叶绿素含量测定方法优劣和快速测定的步骤
叶绿素是光合作用最重要的产物，同时叶绿素含量也是植物重要的生理指标之一。因 此，研究叶绿素的提取方法意义重大。叶绿素含量测定方法一般有分光光度法、活体叶绿素仪法和光声光谱法，以分光光度法应用最广泛。因所用提取叶绿素的溶剂 不同又有多种测定方法，早期叶绿素测定广泛采用叶绿素检测仪，但该方法由于先研磨后除渣，工作量大、步骤多，且容易受光氧化而引起偏差，不适宜田间大量样品的提取和测定。通过比较几种不同混合提取液的提取，提出测定 棉花叶片叶绿素含量的最佳方法为丙酮浸提法。分别对不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果进行了研究，证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性。研究 表明，丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应，且二者在等摩尔混合时提取效果最好，而研究认为，丙酮乙醇（2:1）混合液浸提叶绿素效果较好。该试验在 前人研究的基础上进一步探讨叶绿素含量测定各方法的优劣及快速测定的步骤，为小白菜田间大样本叶绿素含量测定提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将新鲜小白菜叶片洗净、晾干、去大叶脉后剪碎混匀。试验采用752S紫外可见分光光度计，丙酮、95%乙醇等试剂均为分析纯，试验用水为二次水。
1.2 试验方法
1.2.1 不同浸提液提取效果试验
称取0.5 g试材于试管中，剪取叶片成2 mm碎条，在室温下立即用丙酮研磨法和直接浸提法（4种提取液：95%乙醇，丙酮、乙醇（1:1），95%乙醇、丙酮、水（4.5:4.5:1），丙酮、 95%乙醇（2:1））提取叶绿素，3次重复。浸提在黑暗中进行，每支试管加入浸提液10 mL,并不时摇动，等叶片变白，约14 h后定容25 mL,测定吸光值。室温下以相应试剂为参比，分别在645 nm和663 nm处测定吸光度，由Arnon公式计算叶绿素a与叶绿素b的含量。叶绿素a（chla）含量（mg/g）= （12.7×A663-2.697×A645）7×V/（1000W）；叶绿素b（chb）含量（mg/g）= （22.77×A645-4.687×A663）7×V/（1000W）；叶绿素总含量（mg/g）=chla含量+chlb含量。式中A663、 A645分别为相应波长下的吸光度值，V为提取液体积，W为所取叶片质量。
1.2.2 不同浸提液提取效果及稳定性试验
光稳定性试验：将样品于测定后见光放置，分别于放置1、3、5 h后再次测定提取液中叶绿素的变化，比较叶绿素在不同提取液中的稳定性。再使用叶面积测定仪测量小白菜叶的面积，热稳定性试验：用浸提法进行叶绿素提取试验，取提取液10 mL于有塞试管中，水浴中加热，分别在30、50、70℃条件下保温10 min,冷却到室温后，测定叶绿素含量。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法的提取效果及光稳定性比较
由表1~5可知，5种不同提取方法以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法所得总叶绿素含量最高（为0.438）；乙醇浸提法最低（仅0.305）；其它 3种提取方法相差不大。降解值以丙酮研磨法最快（为0.263）；混合液（乙醇B丙酮B水=4.5:4.5:1）浸提法其次（为0.208）；混合液（乙 醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法较慢（分别为0.185和0.165）。说明，丙酮研磨法可能因研磨过程破坏了叶绿体，所提取的 叶绿素在光下极不稳定。而混合液（乙醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法可获得较高的叶绿素含量，同时在光下也有较好的稳定性。
随见光时间的延长，各种提取方法均以叶绿素a降解值远远快于叶绿素b。不同提取方法叶绿素a降解值在0.133~0.288之间变化，而叶绿素b降解值 0.020~0.053之间变化。另外，每种提取方法的chla/chlb值均随见光时间的延长表现出逐渐减小的趋势，也可反映出：
表1 丙酮碾磨法所得叶绿素含量及光稳定性比较
表2 乙醇浸提法所得叶绿素含量及光稳定性比较
表3 乙醇:丙酮=1:1浸提法所得叶绿素含量及光稳定性比较
表4 乙醇:丙酮=2:1浸提法所得叶绿素含量及光稳定性比较
表5 乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1浸提法所得叶绿素含量及光稳定性比较
叶绿素a降解速度快于叶绿素b。说明在可见光下，叶绿素a较叶绿素b更易降解。
2.2 不同浸提液提取方法的热稳定性比较
由表6可知，各浸提方法所得chla、chlb和Chla+b含量均随温度升高而降低，在70℃下，乙醇浸提法几乎全变褐色，而其它处理仍可见到绿色，其中，以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法Chla+b含量为最高。说明，单一乙醇浸提所得叶绿素含量较低且不稳定，而加入丙酮后叶绿素含量提高且较稳定。各处理chla/chlb值也随温度升高而减小，说明在高温下叶绿素a较叶绿素b更易降解，与在光下的变化一致。
表6 不同提取方法的热稳定性比较
3 小结与讨论
混合液浸提法不但所得叶绿素含量高于乙醇浸提法，且对光热的稳定性也优于乙醇浸提法。其中以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提所得叶绿素含量最高。试验中单一乙醇浸提所得叶绿素含量较低，且不稳定，当加入丙酮后叶绿素提取更完全，且稳定性较好。结果表明，丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应，且二者 在等摩尔混合时提取效果最好，这与研究结果一致。
试验中丙酮研磨法也可得到较高的叶绿素含量，这与前人研究结果不同，具体原因有待于进一步研究。
但因研磨法所提取的叶绿素在光下极不稳定，因而这种方法也不可取。综合分析得出，小白菜叶绿素提取效果最好的是混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法，其次为混合液（乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1）浸提法和混合液（乙醇:丙酮=2:1）浸提法，丙酮研磨法和乙醇浸提法效果最差。
随见光时间的延长和温度的增加，各种提取方法均以叶绿素a降解值远远快于叶绿素b。说明叶绿素a降解速度快于叶绿素b,这与的研究结果一致。结果表明，影响叶绿素提取效率的关键是叶绿素a的提取速度及其稳定性保持。
