叶绿素a的分光光度法测定方法介绍
根据所用色素萃取液的不同，叶绿素a的分光光度法测定可分为丙酮法、甲醇法和乙醇法等；根据比色所用的波长分为三色法和单色法，目前国际上普遍使用 Lorenzen单色法。 Lorenzen单色法主要是丙酮法和乙醇法，我国多年来一直沿用丙酮法。近年来，国际上从萃取效果和安全保健等方面考虑已经逐渐改用乙醇法。
（1）丙酮法 该方法适合于藻类繁殖得比较多的水样和表面附着的藻类。
①基本原理。将一定量的水样用玻璃纤维滤纸过滤，收集植物性浮游生物，用90％的丙酮溶液提取，并将提取物分离。
叶绿素a在波长方面的最大吸收峰位于663nm，在一定浓度范围内，其吸光度值A与浓度c符合 Lambert-beer定律，可根据浓度吸光度之间的线性关系，计算叶绿素a的浓度。
②测试方法
a.以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维薄膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，水样抽完后，继续抽1~2min，以减少滤膜上的水分。
b.取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6~8h后放入组织研磨器，加入少量碳酸镁粉末及2~3mL90％丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（3000~4000r/min）分离10min，将上清液倒入5mL容量瓶中。
c.再用2~3mL90％丙酮继续研磨提取，离心分离10min后倒入容量瓶中，重复1~2次，定容至5mL，摇匀。
d.取上清液于1mm比色皿中，以90％丙酮溶液为参照，分别读取波长750nm、663nm、645nm和630nm处的吸光度。同时以90％丙酮作空白对吸光度进行校正。
③计算。叶绿素a的含量按如下公式计算:
（2）乙醇法过滤一定体积（V）的水样（根据样品中叶绿素含量决定），将滤膜向内对折，放入5mL的离心管，保存在-20℃的冰箱中至少一昼夜。
取250mL玻璃三角瓶装适量（约12mL）90％乙醇在控温水浴锅中预热，水浴温度80~85℃，取出样品，立即加入4mL左右热乙醇，水浴2min。再将样品放入室温下避光处萃取4~6h，最长不超过12h。萃取结束后用25mm玻璃纤维滤膜过滤萃取液，并定容至10mL（V1）。
以90％乙醇为参比液进行比色测定，分别测定波长665nm和750nm处的吸光度D665和D750，然后在样品比色皿中加入1mol/L的盐酸化，加盖摇匀，1min后重新测定前面两个波长处的吸光度A665和A750，然后按下式进行计算:
叶绿素a（mg/m3）=27.9V1×［（D665-D750）-（A665-A750）］/V
