真菌RNA提取实验
液氮研磨法
| 实验方法原理 |
液氮研磨可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。 |
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| 实验材料 | 菌丝体 |
| 试剂、试剂盒 | NaCl 蒸馏水 SDS Tris-HCl EDTA DEPC SSTE 乙醇 酒精 酚：氯仿：异戊醇 LiCl |
| 仪器、耗材 | 液氮罐 离心管 离心机 水浴锅 冰箱 紫外分光光度计 电泳仪 |
| 实验步骤 |
1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇），（10 mL加80 ul，50 mL中加入300 ul）。
2. 取约0.8 g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可，固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，按1g材料8 mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。 3. 65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次。 4. 加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10 000 rpm，4℃，5 min）。 5. 取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10 000 rpm，4℃，5 min）。 6. 加入1/4V体积10 M LiCl溶液，4℃放置6h以上（或过夜）。 7. 10 000 rpm，4℃离心20 min。 9. 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10 000 rpm，4℃，5 min）。 10. 加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上。 11. 12 000 rpm，4℃离心20 min。 12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥。 13. 加200 ul的DEPC处理水溶解。 14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。 （在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数。）
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| 注意事项 |
提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。
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| 其他 |
实验试剂准备
1. RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0，DEPC处理的水配置），25 mM EDTA，0.5 g/L 亚精胺Spermidine，2.0 M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可。
2. SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA。
3. 10 M LiCl 直接用蒸馏水配10 M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。 4. DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌。
5. 3M NaAc，氯仿:异戊醇（24:1），酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1），无水乙醇，70%酒精。
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