猪瘟病毒抗体检测试剂盒使用说明
Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit （CSFV Ab）
概述
猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻性病毒（BVDV）以及边界病（BDV）都属于黄病毒属的成员。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已给养殖业造成了巨大的损失。猪感染高致病力毒株后在潜伏期就可以造成传染，经历急性猪瘟或亚急性猪瘟临床症状的猪在出现症状前大量排毒，但耐过后的猪只体内有明显的CSFV抗体，且不再排毒。感染温和性毒株的猪呈慢性感染，在病死前会长期或间歇性地排毒。怀孕母猪可以通过胎盘感染胎儿导致流产、木乃伊化或产出弱猪、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和过程并且是自限性的，但有效的将它们同猪瘟病毒区分是很重要的。
原理
猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒是用来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的检测试剂盒。该试剂盒是用猪瘟病毒抗原包被的微量反应板，利用阻断ELISA原理来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体。如果被检样品中存在猪瘟病毒抗体，它们就会阻断辣根过氧化物酶标记（HRPO）的抗猪瘟病毒的单克隆抗体。单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的结合可以通过辣根过氧化物酶与底物的显色程度进行判定，即用酶标仪在单波长450nm或双波长450nm与620nm测定该反应体系的吸光度。当被检样品中含有猪瘟病毒抗体（阳性结果）时，显色就会变浅，当被检样品中不含有抗猪瘟病毒抗体（阴性结果）时，显色就会变深。样本的阻断率可以通过450nm波长样本吸光度与阴性对照吸光度的比值来确定
试剂
一个ELISA反应板可以检测92份样品（另加两个对照，每个双孔），或46个未知样品，每个样品加双孔。双孔检测法有利于检测结果的准确性。
1. 用猪瘟病毒抗原包被的ELISA反应板
2. 洗涤液（10×）
3. 阴性对照
4. 阳性对照
5. 样品稀释液
6. 辣根过氧化物酶标记（HRPO）的抗猪瘟病毒的单克隆抗体
7. TMB底物
8. 终止液
自备器材
1．微量移液器，50μl和100μl。
2．一次性微量移液器使用的吸头。
3．蒸馏水或去离子水。
4．洗板用的洗瓶或洗板机。
5．温箱或微量反应板用的封条。
6．酶标仪。
注意事项
1．要认真阅读操作说明，按操作说明进行操作。
2．试剂盒及试剂盒中的所有试剂要保存在2~7℃。
3．没有用过的微量反应板必须密封于塑料袋中并保存在2~7℃。
4．不同批次的试剂或说明书不可混合使用。
5．使用处理各个试剂时要小心，严防细菌和真菌对试剂的污染。
6．禁止使用过期的试剂。
7．在处理样本和试剂盒中的试剂时禁止吃食物、喝水和吸烟等。
8．各个样本使用不同的吸头，以防污染。
9．每次检测都要加阳性对照和阴性对照。
10．稀释各种试剂组分时只能使用超纯水。
11．底物溶液对眼睛、皮肤以及呼吸系统都有刺激作用，在使用过程中要防止该溶液接触眼睛和皮肤。
12．终止液中含有强酸HCl,容易引发烧伤，处理该溶液时一定要小心谨慎。
13．用吸量管吸取液体时禁止用嘴。
14．该试剂盒仅用于体外检测。
试剂准备
包被的微量反应板，样品稀释液，阳性对照，阴性对照，酶标二抗，底物溶液和终止液使用前无需处理。
洗涤液（10×）浓缩的洗涤液在使用前必须用超纯水进行10倍稀释。被稀释了的洗涤液可以在4℃的条件下保存3天，或冰冻条件下保存一年。如：250ml 的洗涤液需用25ml的浓缩洗涤液和225ml的超纯水充分混合配成而成。注意：如果浓缩液中含有结晶，在使用之前必须将它融化，应将该液温水浴30分钟以上。
样品准备
新鲜的、冷藏（4°C 少于8 天）的、冰冻的血清或血浆都可以用于检测。
操作步骤
1．在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18~25℃。使用前应将各组分放置于室温至少一小时。
2．分别将50μl 样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
3．分别将50μl 的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。
4．分别将50μl 的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。
5．轻弹微量反应板或用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。
6．将微量反应板用封条封闭或于湿箱中（18~25℃）孵育2 小时，也可以将微量反应板用封条封闭或于湿箱中孵育过夜。
7．吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3 次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔， 弃去反应孔中的洗涤液并拍干反应板。也可以用洗板机洗涤3 次，每个反应孔应加300μl 左右的洗涤液。注意洗板时要小心，以免样本之间的交叉污染。
8．分别将100μl 的抗-CSFV 酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30 分钟。
9．洗板（见6）后，分别将100μl 的底物溶液加入反应孔中，并于避光、室温条件下放置10 分钟。加完第一孔后即可计时。
10．在每个反应孔中加入100μl 的终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。
11．在450nm 处测定样本以及对照的吸光度值，也可用双波长（450nm 和620nm）测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
12．计算样本和对照的平均吸光度值（见计算）。
计算方法
计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。
根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；（阳性对照阻断率以同样方法计算）
ODNEG － ODTEST
阻断率＝ ————————× 100%
ODNEG 3
试验有效性
阴性对照的平均OD450应大于0.50。阳性对照的阻断率应大于50％。
结果判定
如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本就可以被判为阳性（有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本就可以被判为阴性（无抗CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率在30~40％之间，就应在数日后再对该动物进行重测。
如果重测结果仍为可疑，就应用血清中和实验方法鉴定。请参照本国相关的有效规章。
