大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定（一）
大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定
许 川1/舒为群1,/张 亮1/曹 佳2/周 新3
(1.第三军医大学军事预防医学院环境卫生学教研室, 重庆 400038； 2. 第三军医大学军事预防医学院军事毒理学教研室，重庆 400038；3. 第三军医大学西南医院烧伤科， 重庆 400038)
Culture and Identification of Granulosa Cells from Rat Ovary
XU Chuan1, SHU Wei-qun1,, ZHANG Liang1, CAO Jia2, ZHOU Xin3
(1. Department of Environmental Hygiene, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 2. Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 3.Institute of Burn Research， Southwestern Hospital，Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
【摘要】 背景与目的： 探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法，建立一种简便、稳定的细胞模型。材料与方法： 选用SD雌性大鼠(21～25 d)，皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后用颈椎脱臼法处死，剖取双侧卵巢，采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞，0.25％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃，5％ CO2培养箱培养。以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定，用MTT法绘制细胞生长曲线，并检测细胞培养液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 结果： 分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90％，细胞纯度达到95％以上；体外培养的颗粒细胞对数生长期为48～96 h；颗粒细胞具有正常的分泌雌激素功能，在培养24 h细胞培养液中E2和P的分泌量分别为(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 结论： 采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好，用FSHR表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。
【关键词】 大鼠； 卵巢； 颗粒细胞； 培养； 鉴定
中图分类号：R730.45文献标识码： A 文章编号：1004－616X(2009)03－0234－04
【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM: To obtain and identify cultured granulosa cells from the ovary of rats so as to establish a convenient and stable experimental model. MATERIALS AND METHODS: Female SD rats were subcutaneously treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). Forty-eight hours after dosing with PMSG, the animals were decapitated and the ovaries were aseptically removed. Granulosa cells were then released by mechanical method, trypsin digestion and low-speed centrifugation separation were used for granulosa cells isolation. Granulosa cells were diluted and incubated in fresh DMEM-Ham's F-12 medium (1∶1) containing 15％ of fetal bovine serum at 37 ℃ in water-saturated environment of 5％ CO2. Hematoxylin ＆ Eosin (HE) and immunohistochemical staining of FSHR were used for ovarian granulosa cell identification. Additionally, the growth curves of granulosa cells and hormone levels at different incubation times were evaluated as well. RESULTS: Over 95％ of the cultured cells were ovarian granulosa cells．The exponential phase of growth was between 48 and 96 hours of incubation. CONCLUSION: More than 95％ of highly purified granulosa cells could be obtained by mechanical method combined with trypsin digestion and low-speed centrifugation. Moreover, identifications of granulosa cells by HE and FSHR staining were quick and convenient approaches.
【KEY WORDS】 rat; ovary; granulosa cell; culture; identification
颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动[1－2]。环境中有毒有害物质对人和哺乳动物的生殖毒害和机制至今仍在探索中，进行颗粒细胞体外培养是研究化学毒物生殖毒性的基础，是探索卵巢内分泌功能及调控机制的重要手段，而如何获得高质量的颗粒细胞是生殖毒理学研究深入的关键。
尽管国内外有关哺乳动物卵巢颗粒细胞的体外培养已有文献报道[3－5]，但迄今为止，尚无明确标准、高效、稳定的的培养方法，本研究旨在通过改进和完善颗粒细胞的体外培养和鉴定方法，为进一步开展颗粒细胞体外生殖毒理学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
DMEM/F12培养基购自美国HyClone公司，无支原体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司, 孕马血清促性腺激素(PMSG)购自杭州动物药品厂，四甲基偶氮唑盐(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，DAB显色试剂盒、卵泡刺激素受体(FSHR)兔多克隆抗体购自武汉博士德公司，伊红、苏木素购自北京中杉金桥生物工程有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫测定试剂盒购自北京原子高科股份有限公司。
主要仪器包括组织培养显微镜，光学显微镜(Olympus)，CO2培养箱(Thermo Forma)，全自动酶标仪(Thermo)，离心机(湖南湘仪)，GC-911 γ放射免疫计数器(中佳光电仪器分公司)等。
1.2 实验动物
21～25日龄(50～60 g)清洁级健康SD大鼠10只，雌性，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.3 卵巢颗粒细胞的分离与原代培养
参照Lovekamp等[3]介绍的方法加以改进，雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 40 IU，48 h后颈椎脱臼法处死。碘伏、酒精消毒，在无菌条件下迅速剖取卵巢放入预冷的无菌PBS中，去除卵巢周围组织及表面包膜，PBS清洗后置于预冷的DMEM/F12培养基中。在解剖显微镜下用25号针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放入 DMEM/F12培养基，离心管内吹打分散成单个悬浮细胞。加入0.25％胰蛋白酶－0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，于37 ℃，5％ CO2培养箱中消化60 min，期间从培养箱取出用吸管反复吹打悬液2～3次(以组织消化为黏液状、颗粒细胞团块分离为准)，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，200目不锈钢细胞筛过滤。800 r/min离心5 min，洗涤滤液，弃上清收集细胞。向沉积在离心管底的疏松细胞团中加入DMEM/F12培养基(含15％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素) 制成单细胞悬液。台盼蓝染色，计数。将细胞稀释成浓度为3.0×105/ml的细胞悬液，接种于培养瓶中或培养板中，在37 ℃、5％ CO2培养箱中预培养24 h后换液1次，去除未贴壁细胞；此后隔日换液1次。
