大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定（二）
1.4 颗粒细胞鉴定
1.4.1 HE染色 取生长旺盛的第4 d的细胞，用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA消化后制成1×105/ml的细胞悬液，种植于已预置好小盖玻片的24孔培养板中，放人CO2 培养箱中，在37 ℃、5％ CO2及完全饱和湿度条件下进行培养。当细胞生长至70％融合时取出玻片，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min。4％多聚甲醛固定20 min。取出细胞爬片，PBS冲洗2次，苏木素染色2 min，流水冲去浮色，入盐酸酒精中分色数秒，流水冲洗3 min，镜下细胞核染色清晰，胞浆不着色。5％伊红染色2～3 min，流水冲去浮色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片后光镜下观察细胞形态。
1.4.2 FSHR表达鉴定颗粒细胞 细胞爬片制作同前，4％多聚甲醛固定。按以下步骤进行细胞免疫化学染色：固定好的细胞爬片，PBS洗涤3 min×3次；3％ H2O2室温孵育5 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS清洗5 min×3次；加正常山羊血清封闭无关抗原，室温下孵化20 min，倾去不洗。滴加一抗FSHR兔多克隆抗体(1∶200), 4 ℃过夜，PBS清洗 5 min×3次。滴加二抗IgG，37 ℃孵育 60 min；PBS清洗5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉素工作液50 μl， 37 ℃孵育 30 min；PBS清洗5 min×3次。DAB 显色(显微镜下控制显色时间)；自来水冲洗，苏木素复染10 min；自来水冲洗3次；常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.5 细胞生长特性观察
将分离得到的细胞按每孔1×104个接种于96孔板，每孔200 μl。在培养过程中每24 h对试验组进行1次检测，每次检测6个孔，直至接种培养后的第9 d，取各时间点平均值。检测时，每孔添加180 μl 不含血清的培养液和20 μl MTT(5 mg/ml)，37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡 10 min，自动酶联免疫检测仪上测定490 nm处的吸光度值(A)，以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
1.6 雌二醇(E2)和孕酮(P)含量
将生长旺盛细胞接种到24孔培养板，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞，细胞密度为1.0×105/ml，每孔l ml，37 ℃、5％ CO2条件下培养 12 h、24 h后分别收集细胞培养液(在终止培养前3 h加入100 ng/ml FSH)，用放射免疫法测定雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量，以评价细胞的功能状态。
2 结 果
2.1 卵巢颗粒细胞形态学观察
台盼蓝染色表明，实验分离培养细胞的存活率>90％，初始阶段细胞形状呈圆形或椭圆形，其中有部分小而圆的其他细胞(如红细胞)。卵巢颗粒细胞呈单层贴壁性生长，培养24
h后细胞开始贴壁、增殖；培养48
h后细胞明显增殖，贴壁良好，生长旺盛(见图1，2)。经HE染色后，在镜下可见贴壁细胞形态完整，边缘清晰，大小均一，呈多角形或梭形，核染深蓝色呈卵圆形或不规则形，胞浆淡红色(见图3)。卵巢颗粒细胞形态结构与文献报道一致。
2.2 FSHR表达鉴定颗粒细胞
FSHR免疫细胞化学染色是卵巢内颗粒细胞的特异性染色，FSHR阳性染色定位于细胞胞浆，呈棕褐色着染，细胞核呈深蓝色，镜下可见FSHR的阳性率>95％(见图4)，由此表明分离培养的颗粒细胞纯度达到95％以上。
2.3 细胞生长曲线
细胞生长曲线见图5。由图可见，卵巢颗粒细胞培养初期随着培养时间的延长而增殖，培养24 h细胞处于贴壁生长适应期，A值增加不显著，培养48 h后A值开始大幅度的增高，判断细胞迅速进入对数生长期，到72 h细胞生长极度旺盛，A值达到最大值；随后进入平台期，第5 d开始逐渐下降，6 d开始显著下降直至第 9 d结束吸光度测定。
2.4 雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌
12 h、24 h的卵巢颗粒细胞培养液E2和P的分泌量见表1，培养液中E2和P的分泌量随着培养时间的延长均升高，培养24 h后E2和P水平均值分别达到103.36 pg/ml和77.91 pg/ml。
3 讨 论
随着生殖毒理学研究的深入，环境化学毒物引起的各种女性生殖损害已引起了人们的高度重视，通过有效地研究环境有毒有害因子对卵巢颗粒细胞生长发育的影响及其调控机制，可深入了解毒物对卵巢毒性作用机理。目前，毒理学研究中对卵巢颗粒细胞的应用越来越广。如何简便、快速、稳定的分离和培养卵巢颗粒细胞是研究化学毒物生殖毒性的基础和必要手段。
结合已有文献报道，本实验采用21～25 d雌性SD大鼠进行卵巢颗粒细胞体外培养，相比成年大鼠而言，新生大鼠颗粒细胞在离体前未接触过内源性促性腺激素的刺激，采用PMSG刺激雌性SD大鼠使之处于动情前期，获得大量相同发育阶段的颗粒细胞。进而采用机械分离方法使颗粒细胞释放出来，既减少了对细胞的损伤，保持细胞形态完整，又使污染细胞减少。胰蛋白酶消化结合低速离心分离卵巢颗粒细胞可去除其他混入的细胞(如红细胞)及组织碎片，提高颗粒细胞存活率和纯度。体外培养24 h后颗粒细胞开始贴壁生长，48～96 h内细胞大量增殖，生长旺盛，并可获得较高的细胞存活率，实验结果与文献报道一致[3－4]。
鉴于颗粒细胞是卵巢内唯一可表达FSHR的细 胞[6－7]，笔者在通过HE染色观察颗粒细胞形态学特点的基础上，特别采用细胞FSHR表达阳性作为鉴定颗粒细胞的标准。结果表明，在培养的颗粒细胞中，FSHR的阳性率可达到95％以上，获得的高纯度颗粒细胞可最大程度保存细胞的特性，将使系列生殖毒理有关实验数据更加可信。卵泡颗粒细胞在维持雌性生殖功能上具有重要作用，颗粒细胞分泌雌激素为卵细胞的生长和发育提供了重要的微环境。实验期间，颗粒细胞培养液中E2和P分泌量随着时间增加而升高，表明培养的细胞具备并可维持正常的生理功能。
综上所述，纯度高、活性好的原代培养颗粒细胞可为化学毒物毒性评价提供一个很好的实验基础。本实验所建立的细胞培养体系是可行的、理想的，适合进行相关毒理学实验。
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收稿日期： 2008－10－27； 修订日期： 2008－12－24
基金项目： 国家自然科学基金重点项目(30630056)；国家自然科学基金青年科学项目(30800900)；重庆市重大科技专项 (CSTC2006AA7003)
作者简介： 许川(1980－ )，男，湖北荆门人，主治医师，博士研究生，研究方向：环境毒理学。E－mail:xuchuan100@163.com.
Correspondence to： SHU Wei-qun, E－mail: wqshu@mail.tmmu.com.cn
