外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA的检测价值
【摘要】 目的 探讨单个核细胞结核分枝杆菌DNA检测在肺结核诊断中的价值。方法
380例外周血用淋巴细胞分离出单个核细胞，用1%TritonX-100加蛋白酶K提抽模板DNA作PCR扩增，产物227bp。结果
外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检出率为90.3%（343/380）明显高于痰样本71.2%（94/132）。特异性93.3%（42/45）。结论
外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检测可用于结核病的快速诊断，尤其适用于无痰患者、肺外结核及儿童肺结核。
【关键词】 结核； 淋巴细胞； 脱氧核糖核酸； 聚合酶链反应
1994年Schluger［1］首次报告活动性肺结核外周血用淋巴分离液分离出单个核细胞，检测结核分支杆菌（TB）DNA，且敏感性与特异性均为100%。笔者于1997年开始了该项研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
临床病例：活动性结核患者380例，其中肺结核347例，骨结核8例，肾结核9例，淋巴结核15例，皮肤结核1例，皆为经临床表现、细菌学检查、X线、CT胸片检查及临床治疗效果确诊，其中132例留取痰标本。对照组45例，包括肺癌21例，慢性支气管炎5例，支扩6例，哮喘5例，肺炎2例。
1.2 试剂来源 （1）结核杆菌PCR试剂盒由上海复星股份有限公司提供。（2）淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液病研究所提供。
1.3 方法 枸橼酸钠抗凝静脉血2ml，参照《全国临床检验操作规程》用1.077±0.002的淋巴细胞分离液1ml将其分离,2500rpm
10mim,收集云雾状淋巴细胞部分，用生理盐水洗涤两次，加１％ＴritonX-100、蛋白酶K，55℃
1h保温后沸水浴15min，10000rpm
5mim取模板5ml加入25ml扩增反应液。痰标本采用4%NaOH液化，沉淀洗涤两次于-20℃保存备用。加入模板的扩增液置PE2400基因扩增仪94℃
4mim后，按94℃
45s，60℃45s,72℃60s循环35次，最后72℃延伸5mim，用扩增产物10μl经琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察出现与阳性对照227bp同样扩增条带，判定为阳性。
2 结果
活动性结核病人外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检出率90.3%（343/380），其中132例活动性肺结核病人同时留取了痰标本，TB-DNA检出率71.2%(94/132),对照组3例阳性,皆为肺癌患者，检出率6.7%（3/45）。
3 讨论
本资料结果表明90.3%活动性结核病人外周血单个核细胞中存在结核分支杆菌DNA，血流中存在着结核分枝杆菌。雷建平［2］解释认为：(1)进入病灶局部吞噬了结核分支杆菌的吞噬细胞和淋巴细胞游回到血流中；（2）血流中吞噬了结核分枝杆菌并受到抑制、失去活性或衰老死去的吞噬细胞被活性细胞破坏分解，释放的结核分枝杆菌再次被吞噬。有人做过动物实验，用同位素标记人结核菌进入肺泡或肺泡道后，最快6h通过淋巴系统到达血行［3］。证实了结核病人患病过程中，结核病进入血液的可能性。
123例活动性肺结核病人留取痰标本阳性率为71.3%(54/132)，明显低于外周血单个核细胞TB-DNA检出率(90.3%)。用外周血检测明显提高了临床符合率，且减少痰结核分支杆菌污染，易于操作。
笔者的研究结果的特异性93.3%，21例肺癌患者出现的阳性3例，检出阳性率14.3%，雷建平［4］报道住院结核病人3.3%合并肺癌，肺部恶性肿瘤病人中29.2%合并结核病。Brisson报道，在肿瘤组织坏死中隐性病灶中结核杆菌可被释放。建议临床要综合分析检测结果，确诊的肺癌外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA出现阳性，也是可以解释的。
肺外结核诊断外周血单个核细胞TB-DNA检出显示出优越性，临床上对无痰患者、儿童结核、肺外结核的诊断是比较实用的诊断方法，且易于标准化，较痰标本减少传染性。
外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检测，易于保证检测的敏感性和特异性。今后笔者将对完成化疗方案TB-DNA转阴时间再作进一步观察。
【参考文献】
1 Schluger NW， Condos RL， Rom WN. DNA amplification of Mycobacterivm
tuberculosis from patients with pulmonaiy toberculosis.Lancet,
1994,344：232-233.
2 雷建平，熊国亮，苏钢，等.外周血淋巴细胞部份结核菌DNA检测的探讨.中国防痨杂志， 1997，19（3）：131-132.
3 谢惠安，阳国太，林善梓，等.现代结核病学.北京： 人民卫生出版社， 2000，125.
4 雷建平，熊国亮，付洪帆，等. 淋巴细胞部份结核杆菌DNA检测的临床意义.中国防痨杂志，1999， 21（3）：155-158.
