TILLING-高通量点突变筛选方法
TILLING-高通量点突变筛选方法
反向遗传学方法是功能基因组研究的重要方法。为了克服传统的基因敲除方法的局限性，TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技术通过化学诱变的方法产生的大量点突变个体，可以对部分功能缺失的基因及基因分型中亚致死等位基因进行研究。目前，TILLING技术已被大量应用于拟南芥、果蝇、玉米、斑马鱼、苜蓿等多个物种的研究领域。
Ecotilling-高通量SNP发现新方法
SNP可以用来研究物种间不同个体的遗传差异，疾病基因找寻，重要性状相关基因定位等。SNP的找寻需要获得大量个体DNA样本的序列信息，通过大规模测序，可以获得足够的序列信息，从而筛选出SNP。但是该方法耗费巨大，耗时较长。
Ecotilling技术的出现，解决了传统测序的缺陷，不仅分析速度更快，而且耗费很低，尤其适合大规模人群和动植物群体中找寻新的SNP位点，它和Tilling的区别是，Ecotilling使用的材料是自然环境中的群体，而非突变体，后续的实验技术流程与TILLING相同。
高质量的的TILLING/Ecotilling图像 
双色红外荧光检测，产生两个真实的凝胶电泳图像。
未经加工的原始图像防止了突变被过滤得可能性。
双色检测消除假阳性结果
错配的异源双链经酶切后，产生两个片段。两
个片段由不同的荧光标记（如右图）。泳道的两
条突变片段分子量之和应该等于野生型的分子
量，满足条件方可以确定突变。
突变定位
成像程序可以识别存在突变样品位点的泳道并
估算条带的分子量，进行突变位点的定位分析。
高灵敏度的红外检测
红外技术的高灵敏度避免了一些弱信号的丢失。与
其他可见荧光相比较 ，红外技术具有更宽的动力学
范围，弱的突变条带和强的野生条带同时生成高质量的图象。
技术成熟
我们所采用的Licor遗传分析系统是TILLING/Ecotilling技
术的最佳选择。拟南芥Tilling计划（ATP）已经用Licor 4300找到了200多个基因的2000多株突变株。
TILLING 和 ECOTILLING 实验流程
拟南芥的TILLING流程操作示意图
 | 经EMS处理后产生点突变的种子 | ||
 | 第一代植株 | ||
 | 自交产生的性状分离个体 | ||
 | 提取植株DNA样本于96孔中 | ||
 | 将8块微孔板样品合成一块，用两种红外标记的引物做PCR | ||
 | PCR产物经变性和复性，野生型与突变型样品形成异源双链。 | ||
| CEL I 核酸内切酶特异性切断错配的碱基 | ||
| 样本变性后在4300 DNA分析仪上电泳 | ||
| 在含有突变样本的泳道，野生型条带的下方可以观察到条带。700nm和800nm通道均可成像。 | ||
| 在混合的8个样本中进一步确定突变样本。 | ||
Ecotilling的流程从步骤4开始，没有诱变的过程。后续实验过程与TILLING相同。
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产品技术
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