细胞凋亡及其检测技术-3
2、RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达：
（1）总RNA提取：
为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂。操作过程中应避免RNA酶污染器材和试剂，因此所有剥离、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h，然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次，塑料器材应采用高压蒸汽灭菌。玻璃器材应于180℃干烤4-6h，所有溶液配制用水均用已灭菌的新鲜蒸馏水配制，所用试剂要新开封的试剂，或无菌分装至已处理的容器中，操作时应戴60Co辐照的一次性手套，并勤换，以避免环境中和操作时的RNA酶污染。提取总RNA，采用异硫氰酸胍一步提取法即可。
收集药物处理和对照组的肿瘤细胞，用PBS洗2次，冷藏5min。
加入变性液Solution D 1ml。
用4号针头抽打混匀，再加入0.1ml的3mol/L乙酸钠充分混匀，加80%饱和酚1ml，氯仿/异戊醇0.2ml，混匀后置冰上15min。
于4℃、12000r/min离心5min，取上清移入另一洁净的塑料离心管中，加2.5倍体积的无水乙醇于-20℃过夜。
次日以4℃、12000r/min离心30min，弃上清，用70%预冷乙醇洗2次，干燥10min，加100ulDEP 水溶解RNA，再加入300ul变性液Solution D混合，再加2.5倍乙醇，-20℃放2h。
用70%预冷乙醇洗2次，加 EDPC水溶解，紫外分光光度计测OD260值、OD280值。当OD260/OD280在1.8-2之间时，RNA纯度较好。
（2）RT-PCR：
合成cDNA第一链。
各组取5ugRNA进行逆转录，反应体系共20ul：
a、5X逆转录缓冲液5ul；
b、DTT 1ul；
c、dNTP 2ul；
d、Rnasin 1.5ul；
e、Oligo dT 2ul
f、m-MLV 逆转录酶 2ul；
g、RNA样本 5ug
h、DEPC水补充加至20ul。
上述组分充分混合后，现在室温作用10min，后在42℃反应1h，经95深深地10min，立即置冰浴冷却至4℃，逆转录产物即cDNA第一链于-20℃冻存备用。
PCR反应扩增cDNA
a、P1上链，5/-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3/;
b、P2下链，5/-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3/.
外参照物β-actin的引物序列如下：
a、P3链，5/-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3
b、P4链，5/-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3/
扩增的产物长度分别为459bp，339bp。
以逆转录产物为模板分别与bcl-2引物，β-actin引物混合，反应体系共有50ul；
a、双蒸水32.5ul；
b、10 x 缓冲液5ul；
c、MgCl2 5ul；
d、dNTP 1ul；
e、P1/P3 0.5ul；
f、P2/P4 0.5ul；
g、TaqDNA 多聚酶0.5ul；
h、cDNA样品9逆转录产物）5ul。
扩增条件：94℃预变性7min，设计PCR循环程序，94℃变性60s，55℃复性50s，72℃延伸60s，共30个循环周期，然后72℃延伸5min，4℃保存备用，并供凝胶电泳。
每组取PCR扩增产物8ul在TBE缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳（2%）。电压80V，电泳40min，紫外透射仪下观察电泳条带，其荧光带亮度可随凋亡的程度而有变化，证明bcl-2基因表达与不同剂量化疗药物作用时间有关，bcl-2基因表达与细胞凋亡呈剂量、时间依赖性。
六、JAM检测技术
JAM检测技术是用于测定细胞死亡或凋亡的方法，如51Cr稀放法事基于细胞死亡往往伴随有细胞膜破裂及细胞质的释放，用51Cr或125I标记相关的靶细胞，与效应细胞共培养一定时间后，测定一定体积的培养上清中的放射性计数，以反映细胞损伤情况。而人们发现，细胞死亡的早期反应，细胞内DNA被酶裂解成180kb左右的小片段，这一变化发生在细胞膜破裂之前，因而在由CTL介导的细胞死亡早期，靶细胞首先表现为出现DNA碎片。检测出靶细胞的DNA碎片，对于CTL介导的细胞死亡应是一个更为灵敏、准确的方法。Duke等人曾用差异离心的方法进行检测，但这一方法比较费时，不适合应用于较大样品量的常规检测。而Matzinger发现，可以用3H-TdR标记检测细胞增殖的方法加以改进来检测。
（一）检测原理：
用真空抽吸玻璃纤维滤纸上被3H-TdR标记的靶细胞，以测定靶细胞DNA断裂及细胞死亡。由于DNA被抽吸的过程中，DNA碎片可以通过抽吸穿过滤膜，因此只有来自于活细胞的完整的DNA被留在滤膜上，通过测定其cpm读数，即可了解细胞DNA被损伤的程度以及细胞死亡情况。
（二）实验方法：
1、靶细胞的培养及标记：
靶细胞（通常为肿瘤细胞如P815），通常在培养瓶中，用适宜的培养基，37℃、5%
CO2条件下培养，实验前1天将其按（2.5-5）×105个/ml的浓度接种至24孔板中，培养1天后，向培养基中加入3H-TdR进行标记，使终浓度为2.5-5uCi/ml，不要搅动细胞，在37℃、5%
CO2条件下继续培养一定时间，直至使用前。对于生长较快的靶细胞，培养4-6h即可标记，一般则培养过夜。
2、效应细胞的培养：
常规分离获得的C57BL/6大鼠脾细胞，按4×106个/空接种于24孔板中，以300Gy照射过的BALB/C大鼠脾细胞作为刺激细胞，培养5天后，于测试前将细胞收集按一定细胞数重新接种于96孔板中，100ul/孔，并进行一定稀释以达不同的效/靶比（R/T），每组至少设3个平行孔。
3、效应细胞、靶细胞作用：
靶细胞标记结束后，轻轻地将细胞吸出，洗涤1次，再按1×105个/ml浓度重悬，向已含有效应细胞的96孔板中加入100ul/孔的靶细胞，在37℃、5% CO2条件下共同孵育1-4h。
4、收获：
培养结束后，可用目前收集细胞用的细胞收集器将细胞及其培养基抽吸到玻璃纤维滤膜上，依次用双蒸水。三氯醋酸、无水乙醇洗涤及固定滤膜，烘干后，加入闪烁液，用液闪计算仪进行测定。
5、计算特异性杀伤率（%）：
特异性DNA杀伤率（%）=[（S-E）/S]×100%。
