第三届质谱论坛：质谱技术在组学研究中的应用
技术讲座
沃特世科技（上海）有限公司技术专家 贾伟博士
来自沃特世科技（上海）有限公司技术专家贾伟博士带来了题为《蛋白质结构质谱分析技术进行》的报告。贾博士在报告中重点介绍了蛋白质修饰分析、蛋白高级结构分析和蛋白差异构象分析这三方面内容。
蛋白质修饰分析
蛋白质的磷酸化、糖基化修饰分析一般采用串联质谱采集方法。 Waters公司的ZL全信息串联质谱（MSE）技术是指在一次液质分析中同时获得高精确的母离子及碎片离子信息的串联质谱方法，该技术通过母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母-子离子的关联归属。MSE技术的特点在于能对所有的离子信息都被记录，定量、定性更加准确；且全部母离子与碎片离子信息都是高精度、高分辨的质谱数据。贾博士在报告中介绍了MSE技术用于二硫键和糖肽的分析实例。
蛋白高级结构分析
蛋白质组合体的高级结构分析的传统方法包括晶体衍射、核磁、电子显微镜等方法，质谱技术凭借无分子量大小限制，灵敏度高，可分析不均一复合体，以及可检测动态变化这些特点也适用于蛋白的高级结构分析。内源性蛋白质复合体四级结果质谱分析方法包括蛋白质组学方法进行复合体蛋白组成的鉴定，天然质谱法进行复合体整体分子量测定，变性质谱法进行各亚基分子量的测定，串联质谱法测定外周亚基的鉴定，以及离子淌度质谱法进行完整复合体形态分析。
与依赖质荷比分离的质谱不同，离子淌度技术主要依据离子的形态差异进行分离。离子在电场中前进并与惰性气体碰撞，大体积离子碰撞机会多，迁移时间长。蛋白复合体四级结构可根据碰撞截面积，按照投影近似法、轨道法或精确硬球散射模型等方法计算构建。
蛋白差异构象分析
氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry） 是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋 白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信。
但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。
（1）如何避免交换后氘代肽段的回交现象
氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC®系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制。
（2）实验控制的高精确性和重现性要求
对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange系统完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。
（3）交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨
氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其 质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的 判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange 系统能够解决上述问题。
（4）简易高效的分析软件需求
实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。
（5）以氨基酸为单位的交换位点辨析
在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号。
沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange系统为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。
沃特世科技（上海）有限公司技术专家 袁洞安博士
最后，来自沃特世科技（上海）有限公司技术专家袁洞安博士为大家详细介绍了Waters超高效合相色谱的技术特点及其应用。袁博士首先指出亚二微米填料技术和超临界色谱技术的完美结合，已经超出传统意义的超临界色谱概念，提供了全新的分析思路。
Waters公司最新推出的ACQUITY UPC2系统基于超临界流体色谱(SFC)技术，SFC选择CO2作为超临界流体的原因在于：CO2在31.1℃和73.8bar的条件下便能达到超临界状态，又由于CO2无毒、不易燃且不污染环境，是一种化学纯度高、稳定且非极性的溶剂，并且兼容与大多数的LC检测器，对MS友好。
超临界流体色谱(SFC)技术
与GC相比，SFC的流动相具有类似于液体的密度，为常压气体的200～500倍，具有较高的溶解能力，适于分离难挥发和热不稳定性物质，而GC需将样品气化后才能进行分离操作，不适合于难挥发及热不稳定物质的分离。
与HPLC相比，SFC的流动相具有较小的粘度，可减小过程阻力，在相同条件下，压力降比液相色谱的低；SFC具有较高的扩散系数和传质速率，SFC分离操作的时间短，单位时间内分离效能高。对于制备来说，除了分离速度快以外，后处理也非常简单。
SFC与HPLC和GC相比，温度和压力的微小变化能引起SFC流动相的密度和溶解能力的较大差异，可通过调节温度、压力来调节分离度。
SFC仪器基本配置与HPLC相似，热交换剂和反压调节器能够确保整个系统中二氧化碳始终保持它的液相状态，其中反压调节器和二氧化碳冷却泵是通HPLC的主要差别之处，改良的PDA流通池用于满足压力的需求。同时SFC由于采用CO2作为超临界流体，实现了资源浪费小、原料利用率高、毒性小、且能循环使用，因为SFC是一款绿色色谱。SFC可被广泛应用于食品安全、天然产物、法医、环境、石油化工、药物开发等领域。
ACQUITY UPC2系统—提供无线分离可能
ACQUITY UPC2系统是沃特世长期以来设计和开发的高品质分析仪器产品之一，它也同样带有沃特世的品牌特性：耐用、可靠并且容易使用。这套系统有以下重要特征：
•10μL固定进样环，进样体积范围0.5μL~10μL，节省样品且不需更换进样环。
•系统体积小，有利于缩短运行时间，优化梯度性能，减少谱带展宽，最大程度发挥小粒径色谱柱的性能。
•共溶剂选择和柱切换技术，流动相和色谱柱筛选过程更加快捷，方法开发更方便。
•梯度准确性和精密性保证了保留时间的重现性。
•同时兼容光学检测器和MS检测器，是定性和定量分析的理想选择。
沃特世ACQUITY UPC2系统，加上行业领先的亚2μm色谱柱，科学家们能够精确地调节流动相强度、压力和温度获得所需要的系统分辨率和选择性，对待测物的保留和分离进行有效调控。这非常适合结构类似物、 异构体以及对映体和非对映体的分离、检测和定量——而这类分析任务是其它方法不能或很难实现的。
论坛结束后，与会者一同参观了北京师范大学质谱中心。
Waters公司ACQUITY UPLC -Xevo TQ MS系统
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