第二期赛默飞世尔科技质谱用户沙龙活动报道
军事医学科学院六所 李敬来老师
来自军事医学科学院六所的李敬来老师作了题为《苯环壬酯手性对映体体内拆分与立体选择性动力学研究》的报告，主要从研究背景、研究目的、研究方法上介绍了8021消旋体在比格犬体内测定拆分方法的建立过程。
实验室基本介绍
李老师首先为我们介绍了军事医学科学院药物代谢与药代动力学重点实验室的基本情况。实验室组建于六十年代，在“十五”、“十一五”“十二五”期间获得了国家科技部“863”重点项目基金和重大新药创制资助，是国内四家全面提升药物代谢平台建设之一，在2004年和2006年获得了北京市科委和国际合作项目的资助，建立了早起药物代谢性质快速评价的体系;2009年到2010年承担了117项新药系统评价的临床项目，其中包括53项重大新药创建资助服务的项目。目前实验室拥有LC-MS10台、GC-MS2台、HPLC多台、专门用于生物技术药物代谢研究的毛细管电泳仪和定量PCR仪以及配套的放射性同位素实验室设备。实验室目前的技术优势
在国内最早开展了生物技术药物的药代动力学研究，承担了国内大部分的生物技术药物的药代评价任务。在国内率先采用巨型计算机和VolSurf软件预测待合成、筛选化合物的细胞膜透性、P-糖蛋白外排及蛋白质结合等体内转运过程。建立多种体内、体外药代实验模型和快速评价技术，配合药物设计开展化合物成药性预测。在国内最早利用配套的放射性同位素实验设备开展研究药物的组织分布。拥有一个新药研究多学科合作群体，为药代动力学研究提供了强有力的技术支持。
研究背景
苯环壬酯(8021)是研发的创新结构的M受体拮抗剂，消旋体为国家I类新药被批准上市，主要用于抗晕动药。大量的实验研究发现，L-8021在可逆性胆碱酯酶一只鸡引发的免逆向转圈综合征和猫运动病样综合征两种动物运动病模型上，左旋体比消旋体具有更好的抗晕效果。进一步的药理学基质研究表明其活性异构体为左旋8021，右旋体无效。开发手性药物的光学异构体，能够提高药效，降低对毒副作用。因此，对手性药物的单一光学异构体的开发研究已经成为新药研究的重要内容。
研究目的
(1)根据SFDA对已上市消旋体开发单一对映体的要求，建立体内手性对映体拆分和定量测定方法，测定优映体转化为另一对映体的程度是否显著，研究优映体单独用药是否与作为外消旋体组分时的药代动力学性质一致。
(2)比较手性对映体的代谢差异性。
(3)为药效和地理学提供参考依据，逐渐积累手性药物代谢研究经验。
8021消旋体在比格犬体内测定拆分方法的建立
李老师介绍从色谱柱、有机溶剂及比例、缓冲溶液及比例、温度四个方面摸索了拆分方法的建立过程。
手性色谱柱包括有7类：“刷型”手性固定相(CHIRALPAK AD-RH)、手性聚合物固定相(CHIRALPAK AS-RH)、环糊精类固定相(CHIRALCEL OD-RH)、大环抗生素固定相(CHIRALCEL OJ-RH)、蛋白质固定相(ULTRON ES-OVM)、配体交换固定相、冠醚固定相。经过比较最终选择了蛋白质类的手性柱ULTRON ES-OVM作为固定相。
有机溶剂种类对分离度的影响：研究发现将常用的有机溶剂甲醇、乙腈与水混合作为流动相时，均不能获得良好的效果，而用乙醇、异丙醇时可以得到较好的分离。
有机溶剂的比例对分离度的影响：在手性拆分时对有机溶剂的要求比较高，因为比例的变化范围比较窄，有机相的比例越低在手性柱上的保留时间会越长，研究中发现当乙醇比例在16%时分离效果最好。
有机添加剂(缓冲液)种类和比例对分离度的影响：在使用5mM磷酸氢二钠和5mM乙酸铵作为缓冲液进行分离的时候比较发现，采用5mM的乙酸铵可以达到较好的效果。
温度对分离度的影响：升高色谱柱温度会使峰形变得锋利，缩短分析时间，但是会降低分离度，因此需要稍稍降低色谱柱的温度。
研究结果
考察了手性固定相、有机溶剂种类和比例、缓冲溶液种类和浓度对对映体拆分的影响，建立了生物样品中8021手性异构体分离定量方法，为手性药物立体选择性动力学研究提供了方法学基础。
实验结果证明8021优映体在动物体内均不发生构型转化，阐明了药效作用手性物质基础就是优映体本身。
8021以外消旋体形式用药时，右旋体的吸收程度明显高于左旋体，并抑制左旋体的吸收，左旋体单独用药时吸收程度明显高于消旋体给药，开发左旋体能增加药效并且降低副作用。
采用LC/MS/MS和GC/MS分析鉴定手段，结合稳定性同位素掺入技术，8021左旋体和消旋体在大鼠体内均发现11个代谢产物，其中4个结构与以往相同，7个为新发现产物。大鼠灌胃给药8021左旋体和消旋体后，代谢产物基本一致，但代谢产物量上有明显差异。
中科院遗传发育所 刘科辉 老师
来自中国科学院遗传与发育生物学研究所的刘科辉老师作了《Orbitrap Elite在翻译后修饰蛋白质组研究中的初步应用》的精彩报告。
中科院遗传与发育所概况
2001-2003年经由原中国科学院遗传研究多、发育生物学研究所及石家庄农业现代化研究所整合而组成，构建有植物基因组学国家重点实验室、植物细胞与染色体工程国家重点实验室、分子发育生物学国家重点实验室和河北省节水农业重点实验室。遗传发育所瞄准农业可持续发展和人口健康的归家重大战略需求，针对重要农艺性状分子机理、细胞分化与器官发育、生物分子网络、动植物品种设计以及农业资源高效利用等领域的关键科学问题，开展原始创新和继集成创新研究，提出和发展具有重大影响的科学理论和概念;建立和完善动植物品种分子设计和培育的方法，重要遗传疾病研发以及农业资源高效利用的技术体系。
目前实验室配备的研究蛋白质的仪器设备包括LTQ-Orbitrap-Elite、TripleTOF 5600、Autoflex MALDI-TOF等。
蛋白质组学的介绍
蛋白质组的研究与其他的小分子的研究有点区别，后者主要是发现和研究大自然中已经存在的对象，前十年的研究中蛋白质组学致力于由蛋白质根据中心法则寻找对应基因的库的建立，目前的重点在于研究在有基因转录翻译成蛋白质的过程中会发生很多的修饰，而这些修饰才是执行生物功能的关键，研究这些修饰是对蛋白质组学研究的一项挑战。
翻译后修饰的认识
翻译后修饰是翻译后的化学性修饰，在功能性蛋白质的合成中发挥着重要作用，通常是来调节细胞活动的，能够发生在蛋白质生命周期的任何一步，蛋白质的翻译后修饰在蛋白质性质的修饰上是可逆的，存在有200多种翻译修饰的酶，包括激酶、磷酸酶、转录酶和连接酶等。
翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化、类泛素化、硝基化、乙酰化、酯化等修饰。
Orbitrap Elite组合式质谱仪
Thermo Scientific Orbitrap Elite组合式质谱仪结构
刘老师所在课题组利用Orbitrap Elite组合式质谱仪的特点，针对着以上翻译后的修饰进行了许多工作。Orbitrap Elite组合式质谱仪的特点是各个模块、各种参数均可以调节，通过利用各种不同的方法来优化这些参数以达到鉴定的目的。Orbitrap Elite以MSA的方式进行工作，在做磷酸化修饰时肽段上的磷酸根容易发生作用丢失，发生作用丢失后在普通的裂解方式中就会很难检测到磷酸根，MSA的工作方式保证了在磷酸根丢失后可以自动调整打碎的能量，最后得到打碎前后峰图的比较，从而提高了磷酸化鉴定的效率，在得到谱图后可以根据谱图上显示的分子量匹配出相应的氨基酸序列，由氨基酸序列在蛋白库中找到蛋白质。例如在做泛素化的时候，本身作为一个肽段，需要连接到目的肽段上去，导致分量很大，此时就需要高能裂解HCD的方式去将之打碎，这是Orbitrap所特有的。
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