DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤2
三、操作步骤
（一）取材、冰冻切片：
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（见图2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。
（二）探针制备与检测（定量）：
1. 随机引物制备cDNA核酸探针以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：
（1）探针制备：
①模板DNA（0.5-3 μg） 15 μl，100℃变性10 min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反应总体积为20 μl。37℃孵育过。
③在上述20 μl 的标记产物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20℃放置 2 hr。4℃离心12 000 g×15 min，弃上清。70%乙醇（预冷） 50 μl 洗涤，7 500 g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）探针敏感性检测：
①样品稀释：取dig-标记探针1 μl 用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀释。
②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置点样器上，负压抽吸5 min。
③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10 min。
④取下尼龙膜，置紫外灯下10 cm 处照射5 min，晾干。
⑤将膜置于适量预杂交液（5-10 ml）中，37℃预杂交10 min。
⑥加入Anti-dig 抗体（1：5000），37℃杂交30 min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。
⑧显色：15 ml TSM2中加300 μl 显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30 min。
2. PCR法制备cDNA核酸探针：
（1） 探针制备：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：
在0.5 ml 离心管中，依次加入：
PCR引物 1（10 pM） 2 μl；
PCR引物 1（10 pM） 2 μl；
质粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；
PCR DIG mix 2 μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）；
dNTPmix 2 μl；
10×PCR buffer 5 μl；
Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；
加入适量ddH2O，使总体积达50 μl。
① 将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7 min。
② 在上述PCR产物中加入4 M LiCl 12.5 μl、预冷无水乙醇375 μl，轻轻混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，弃上清。70%乙醇（预冷） 120 μl 洗涤沉淀，离心7500g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存备用。
（2）探针检测：
行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。
（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：
1. 0.1 M PBS （pH 7.2） 浸 5-10 min。
2. 0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。
3. 0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。
4. 0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃孵育30 min。
5. 4%多聚甲醛浸5 min。
6. 0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。
7. 预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。
（1）杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20 μl 杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过。
（2）洗片：
4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；
0.2×SSC 37℃洗10 min；0.2×SSC与0.1 M PBS各半洗10 min；
0.05 M PBS 洗 5 min×2次。
10. 3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。
11. 滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过。
12. 0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鲜配制TSM2 10 min×2次。
13. 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过。
14. 将玻片置于TE中10-30 min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。
15. 显微镜下观察结果。
四、注意事项：
1. 作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。
2. cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5 min，冰浴骤冷
