旷场实验和水迷宫实验相关：黄芩醇提物干预 D-半乳糖...
旷场实验和水迷宫实验相关-黄芩醇提物干预 D-半乳糖致衰老大鼠的尿液代谢组学研究
黄芩醇提物干预 D-半乳糖致衰老大鼠的尿液代谢组学研究
摘要: 研究黄芩对 D-半乳糖致衰老模型大鼠的影响, 初步探讨黄芩的抗衰老作用机制。将SD大鼠随机分为5组, 即空白组、模型组、黄芩低、中、高剂量(分别为 50、100 和 200 mg·kg−1) 组, 采用皮下注射 D-半乳糖(100mg·kg−1)法, 建立亚急性衰老大鼠模型, 并分别评价衰老大鼠的空间学习记忆能力(Morris water maze)和自主活动(open-field test)。采用代谢组学技术对模型大鼠尿液进行NMR数据采集并结合多元统计分析, 探讨抗衰老机制。结果表明, 黄芩3个剂量均能改善衰老大鼠的行为能力。多元统计分析结果显示, 黄芩低中高剂量组能使衰老大鼠尿液中柠檬酸、丙酮酸、乳酸、泛酸、三甲胺和β-羟基丁酸等6个标志物发生不同程度的回调, 主要涉及能量代谢、糖代谢和肠菌代谢等代谢途径的调节,表明黄芩发挥抗衰老作用与这些途径相关。
关键词: 黄芩; 抗衰老; 行为学研究; 代谢组学
黄芩是唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根,具有清热燥湿、泻火解毒、止血和安胎的功效。现代学者对其药理活性的研究主要集中在抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化、清除自由基和对缺血再灌注损伤的保护作用等方面。近年来研究表明, 黄芩水提物可以提高快速老化模型小鼠的胸腺指数,同时可升高小鼠体内抗氧化酶的活性,黄芩醇提物能改善老年痴呆小鼠体内的氧化损伤、神经炎症和记忆损伤, 但黄芩对D-半乳糖致衰老大鼠模型的研究则未见报道。
衰老是机体组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化,是基因、环境和生活方式等多种因素共同作用的结果。随着年龄增长,一些疾病例如阿尔茨海默症、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和癌症等发生的风险会明显增加。具有抗衰老活性的天然产物如中药和植物药的应用日益广泛, 这对于抗衰老知识的积累具有重要意义。
代谢组学是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法,可通过揭示新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律,全面理解病理变化过程及机体内物质的代谢途径。目前,基于核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)的代谢组学技术已经成为一种强有力的工具,广泛应用于基础生物学、分子病理学、临床诊断、生物医药和环境科学等领域。由于衰老过程的复杂性,目前对于衰老的发生机制尚未完全清楚。近年来,包括代谢组学技术在内的高通量技术的应用,为衰老的病理生理学机制提供了新的解释,并且可以在不同物种中鉴定与衰老相关的特异标志物。
D-半乳糖致衰老模型目前应用最多,该模型具有寿命缩短、学习记忆障碍、神经系统退行性改变、免疫力和繁殖力低下等多种衰老表现,在多种器官组织形态及生理生化的许多指标上呈现出与自然衰老相似的改变,广泛用于衰老机制研究及抗氧化剂、延缓衰老药物的药效学评价。许多研究表明, D-半乳糖致衰老大鼠的自发行为(旷场实验) 会减少,空间记忆能力也会有损伤(水迷宫实验)。
本文拟采用D-半乳糖致衰老大鼠模型, 通过行为学考察,验证黄芩的抗衰老作用, 采用基于1HNMR的代谢组学方法对大鼠尿液代谢物的变化进行测定分析,初步阐明黄芩延缓衰老的作用机制, 为黄芩的开发利用提供一定的理论基础。
材料与方法
药材 黄芩药材购自山西陵川县六泉中药材合作社,由山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根, 样品保存于山西大学中医药现代研究中心。
动物 SPF级雄性SD大鼠, 体重(180±20) g, 北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号SCXK (京) 2012-0001;动物饲养室保持温度(23±1.5)℃,相对湿度(45±15)%。动物适应 1 周后开始实验。
仪器与试剂 Bruker 600-MHz AVANCE III 核磁共振检测仪(德国布鲁克公司); Sartorius BSA124S 分析天平(德国 Sartorius 公司); Morris 水迷宫(上海欣软公司)；旷场实验箱（上海欣软公司）。HPLC分析用甲醇为色谱(Fisher公司); D-半乳糖(Amresco公司),三甲基硅烷丙酸钠盐(TSP, Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA), NMR 试剂重水(Norell, Landisville, USA), 娃哈哈纯净水。
黄芩提取物制备方法 取黄芩粉末20g,分别用10 倍量的60%乙醇和蒸馏水作溶剂回流提取 2 次, 每次2h,合并两次提取液,减压回收溶剂,冷冻干燥得粉末。分别取黄芩水提物和醇提物适量,按照药典方法测定黄芩苷的含量,以其含量的高低作为溶剂选择的依据。
动物实验 雄性SD 大鼠 50 只,随机分为空白组,模型组,黄芩低、中、高剂量组,每组10只。模型组与黄芩低、中、高剂量组每天皮下注射D-半乳糖 100 mg·kg−1,连续 10 周,空白组注射等体积的生理盐水。黄芩低、中、高剂量组每天分别按剂量50、100 和 200 mg·kg−1灌胃给药, 空白组与模型组每天灌胃等体积的蒸馏水,连续10 周。
行为学考察
旷场实验 旷场实验于造模第10 周进行,将大鼠放入旷场行为测试箱的中心位置,适应 2min后,观察 4min 内大鼠的直立次数、静止时间和穿越格数。
Morris 水迷宫实验旷场实验结束后,开始 Morris水迷宫实验。采用XR-XM101型Morris 水迷宫视频分析系统进行测试,实验器材由圆形水池和自动录像分析系统两部分组成。圆形水池由ABS制成,直径160 cm,高 50 cm。水池被等分为4 个象限, 水深30cm,平台位于任一象限的中间,且表面低于水面l～2 cm。水温保持在25℃左右。池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。经Supermaze软件分析处理, 得到实验数据。水迷宫实验环境要求安静,避免一切外界干扰,保持房间安静,温度适宜,光线柔和,实验期间迷宫外的参照物始终保持不变以供大鼠定位。
实验程序参照Morris等的方法进行,测试包括: ① 定位航行实验, 用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力,即记录其潜伏期。历时5 天,训练时随机选择一个象限将大鼠面向池壁放入水中, 迫使大鼠学习寻找设于水面以下的平台。电脑中记录 60 s 内寻找平台所需时间即潜伏期。如果60 s 内未能找到平台,可将其引导至平台并在平台停留 20 s, 潜伏期记录为 60 s。每天训练 4 次,每次训练间隔10 min。系统自动记录多项参数; ② 空间探索实验, 用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后撤去平台,将大鼠面向池壁任选一个入水点放入水中,可以记录60 s内穿越原平台位置的次数及在目标象限的活动路程和活动时间并进行比较分析。数据收集和处理由Morris水迷宫系统软件完成。
样品采集与制备及测定条件 尿样采集与储存: 所有大鼠于第10周末晚上 18:00 至第二天早上 8:00放入代谢笼,冰上收集尿液, 12 000 r·min−1离心,取上清液,于−80℃储存。
样品前处理: 解冻样品,摇匀, 在4 ℃下12000 r·min−1离心 10 min,取尿液0.4 m L,置于核磁管,加PBS (p H 7.0) 0.2 m L, 再加入 D2O 0.1 m L,放置 10 min, 进行核磁测定。
样品于 600 MHz NMR(25 ℃)仪上测定,采用NOE-2DSpectroscopy (NOSEY)脉冲序列。测定频率为600.13 MHz,扫描次数为64,谱宽12345.7 Hz,脉冲时间14 s,采样时间2.654 s,延迟时间1.0 s,采样数据点65536, FID 分辨率0.188 Hz,采样间隔40.5 s,内标为TSP。
1HNMR 谱图数据处理与分析 核磁图谱采用Mest Re Nova (version 8.0.1, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, 西班牙) 进行处理。所有光谱进行手动相位、基线调整。图谱中,以TSP的化学位移δ 0.00为标准进行定标,以δ 0.04对化学位移区间 δ0.00～9.40进行分段积分,其中 δ 4.60～5.00 (残余水峰,尿素峰) 不进行积分,并将积分数据进行归一化,导入Excel软件中进行下一步多元统计分析。将上述处理的积分数据导入SIMCA-P13.0(Umetrics, Sweden)软件中进行主成分分析(principal component analysis, PCA),再用偏最小二乘法判别分析 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal PLS-DA, OPLS-DA)找出样品间差异代谢产物。
统计学处理 数据采用 SPSS 17.0 软件处理,以x ±s 表示,采用单因素方差分析及t 检验对行为学指标及差异代谢产物进行统计学分析和比较,以 P< 0.05, P<0.01 为差异具有显著性。
讨论
本研究复制了衰老模型,使大鼠明显出现了以学习记忆能力下降为主要表现的认知功能障碍。
尿液是机体整体代谢终产物输出的主要途径之一, 尿液中代谢物的变化不仅能够反映机体整体代谢的特征,还可能是局部组织或器官功能异常的外在表现。本研究采用1H NMR分析手段检测出20多种尿液中代谢产物,主要包括脂肪酸类、氨基酸类和有机酸类等代谢产物。
本研究进行组间两两比较发现,柠檬酸、乳酸、泛酸、三甲胺、α-酮戊二酸、丙酮酸、β-羟基异戊酸和β-羟基丁酸受D-半乳糖影响较大,可能为D-半乳糖致衰老模型的潜在生物标志物。给予黄芩干预后,柠檬酸、乳酸、泛酸、丙酮酸、三甲胺和β-羟基丁酸有不同程度的回调, 其中以黄芩高剂量效果最为显著。
通过对潜在生物标志物分析,发现黄芩延缓衰老主要涉及两条代谢路径: 三羧酸(TCA)循环和丙酮酸代谢。TCA循环产生的ATP 是组织细胞能利用的主要能源来源,在这一过程中产生的ATP 都是经由呼吸链产生的,模型组中 TCA 循环的中间体柠檬酸和 α-酮戊二酸均降低, 说明机体衰老也使得TCA能量代谢水平降低,其中间代谢物水平也相应降低。研究表明,如果与能量代谢相关的基因下调会造成能量产生减少,损伤ATP依赖的下游过程,如突触结构和功能的完整,泛素依赖的蛋白降解途径,而这两者都在阿尔茨海默症(AD)中受影响。
丙酮酸是体内产生的三碳酮酸,在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸的变化对于评价体内炎症发生有重要的作用。在炎症时,即使有氧条件下机体优先进行丙酮酸转化为乳酸的代谢, 这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg 效应。丙酮酸的变化与糖酵解及TCA 循环等密切相关。D-半乳糖刺激时,丙酮酸明显增加,其原因是糖酵解和TCA 循环发生障碍。黄芩可以降低尿液中丙酮酸的含量,使糖酵解和TCA 循环代谢恢复。
丙酮酸代谢和TCA循环都发生在线粒体内,这就提示黄芩可能通过代谢路径的调节促进线粒体呼吸,保护线粒体功能,最终与延缓衰老有关。线粒体广泛分布于各种真核细胞内,是进行氧化代谢的部位,是糖类、脂肪和氨基酸代谢释放能量的场所。除为细胞活动提供能量外, 线粒体还参与一些重要代谢通路,参与细胞凋亡、信号转导调控等生化功能,大量实验研究表明线粒体在衰老进程中发挥着至关重要的作用。
与空白组相比,模型组中乳酸含量升高。在认知严重损伤的犬和早发性AD患者中也出现类似的结果,乳酸含量是正常组的4 倍。乳酸水平的升高不仅说明糖异生、碳水化合物和能量代谢发生变化,还说明脑中糖代谢损伤,这是造成认知损伤的一部分原因。此结果与行为学结果吻合。
三甲胺是由胆碱和肉碱在肠道细菌酶作用下的降解产物,肠道菌群代谢的改变与衰老相关的疾病有关。模型组三甲胺含量升高,表明随着年龄的增长,肠道菌群代谢会发生紊乱。而黄芩高剂量可以降低三甲胺含量,说明黄芩发挥抗衰老作用与调节肠道菌群的正常代谢有关。
本研究结果表明,黄芩对衰老大鼠的记忆损伤及自发行为的下降均有改善,黄芩延缓衰老的作用机制可能与调节能量代谢、糖代谢和肠菌代谢等代谢途径有关。
