强迫游泳、悬尾和旷场实验相关-温阳解郁汤对抑郁模型...
强迫游泳、悬尾和旷场实验相关-温阳解郁汤对抑郁模型大鼠HPA轴的影响
温阳解郁汤对抑郁模型大鼠HPA轴的影响
摘要：目的：研究温阳解郁汤对慢性应激抑郁大鼠HPA轴的影响，初步探讨其抗抑郁作用的机制。方法：雄性Wistar大鼠，随机分为6组，正常对照组和模型对照组灌胃0.9%氯化钠溶液，温阳解郁汤高、中、低剂量组灌胃温阳解郁汤浓缩煎剂（8、6、4g/kg）、阳性药对照组灌胃盐酸氟西汀（3.33mg/kg），除正常对照组外其余各组在灌胃同时接受慢性不可预知温和刺激（CUMS）刺激并孤养28d。采用强迫游泳实验（FST）、悬尾实验（TST）、旷场实验（OFT）对各组大鼠进行行为学评价；q PCR检测大鼠下丘脑CRH m RNA和海马GR m RNA的表达；放射免疫法检测大鼠血中ACTH、CORT的含量；HE染色大鼠海马观察组织形态变化。结果：温阳解郁汤能够减少大鼠FST和TST不动时间，增加OFT穿格次数（P<0.05）；能够降低由慢性应激引起的CRH、GR、ACTH、CORT水平升高（P<0.05），并能减少海马组织损伤。结论：温阳解郁汤能够改善CUMS大鼠的应激抑郁行为和慢性应激时高糖皮质激素对大脑的损害，其作用机制可能与调节HPA轴有关。
关键词：温阳解郁汤；抑郁症；下丘脑-垂体-肾上腺轴
抑郁症作为一种特殊的精神疾病，具有一系列广泛的症状，包括快感缺乏、无助、悲伤和绝望，并且被认为是与环境（例如应激或创伤）和遗传因素有关。当机体处于应激状态时，机体通过调节交感-肾上腺髓质系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic pituitary gonadal axis，HPA）使机体获得稳定、恢复稳态，一定程度的应激对机体是有益的，但是长期应激，则可以引起抑郁症的发生。HPA轴是重要的内分泌轴，是神经内分泌网络的枢纽，对维持机体内环境的平衡起着至关重要的作用。研究表明，抑郁症的发生与HPA轴功能的紊乱有密不可分的关系。中医通过温补肾阳、理气解郁，对抑郁症有很好的治疗效果，在抑郁症的治疗中越来越得到重视。本研究建立经典的慢性不可预知温和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，研究温阳解郁汤对抑郁模型大鼠HPA轴的影响，探究该方抗抑郁的机制。
材料与方法
1. 材料 180只SPF级雄性Wistar大鼠，初始体质量150-180g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700073683。盐酸氟西汀分散片购自西班牙礼来公司，20mg，批号：4089A；皮质醇（cortisol，CORT）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放免试剂盒购自北京华英生物技术研究所；总RNA小量制备试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成；2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans Script TM Green Two-Step q RT-PCR Super Mix、Trans DNA Marker I均购自北京全式金生物技术有限公司；其它实验相关试剂均由山西省中西医结合医院中心实验室提供。
2. 温阳解郁汤浓缩煎剂制备 温阳解郁汤组成药物：桂枝、附子各15g，炙甘草10g，生姜、乌梅各30g，大枣5个；以上药物按比例称取，加入药材重量10倍量70%乙醇溶液提取3次，第1次为1.5h，第2、3次分别为45min，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏状，减压干燥成干膏并粉碎成细粉，过80目筛备用。
3. 分组、造模及给药 将Wistar大鼠首先饲养7d以适应环境，最后1天用Supermaze视频跟踪分析系统进行Open-field行为学测定，选取评分相近的180只健康雄性大鼠，依照体质量随机分为6组，每组30只。空白对照组和模型对照组大鼠灌胃0.9%氯化钠溶液；温阳解郁汤高、中、低剂量组分别灌胃温阳解郁汤浓缩煎剂8、6、4g/kg（相当于生药18.6、27.9、37.2g/kg）；阳性药对照组灌胃盐酸氟西汀（3.33mg/kg）。各组灌胃容量均为0.2m L/10g，灌胃28d。除正常对照组外，其余各组灌胃同时采用CUMS结合孤养刺激。选用夹尾（1min）、噪音（1h）、闪光（1h）、冰水游泳（4℃，5min）、潮湿垫料（100m L，24h）、倾斜笼具（30°，24h）、昼夜颠倒、禁食、禁水9种温和刺激，于每日9：00和16：00随机安排刺激方法，刺激28d。第29天进行行为学评价、取材和指标测定。
4. 大鼠行为学评价 本实验采用的以下行为学实验仪器均购自上海欣软信息科技有限公司，强迫游泳实验（forced swim test，FST）：大鼠游泳6min，记录后4min内的累计不动时间；悬尾实验（tail suspension test，TST）：大鼠夹尾悬挂6min，记录后4min内累计不动时间；旷场实验（open field test，OFT）：在敞箱内记录大鼠5min内测定运动格数和理毛次数。
5. 血清CORT和ACTH水平的测定 行为学评价之后，每组取20只大鼠测定其血清CORT和ACTH水平。将大鼠迅速腹主动脉取血，置于离心管内，4℃ 4 000r/min离心10min，取血清，-20℃保存待测。采用放射免疫法检测CORT和ACTH的含量。
6. 大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）m RNA及海马糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR） m RNA表达水平 取血结束后，每组取10只大鼠，于冰盘中急速开颅取脑，剥离大脑下丘脑和海马，-70℃保存。分别提取下丘脑和海马总RNA，RT-PCR逆转录为c DNA。采用q PCR法检测下丘脑CRH m RNA及海马GR m RNA表达水平。根据Genbank中大鼠基因序列设计引物，CRH引物：上游：5’-AGC CGC CCA TCT CTC TGG ATC TC-3’，下游：5’-TCC CGA TAA TCT CCA TCA GTT-3’；GR引物：上游：5’-GAT TGA ACC CGA GGT GTT GTA TGC-3’，下游：5’-CGG CAA ATG CCA TGA GAA ACA TCC-3’；β-actin引物：上游：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3’，下游：5’-ATG TCA CGC ACG ATT TCC C-3’。读取Ct值，采用2-ΔΔCt计算CRH m RNA的相对表达水平。
7. 大鼠海马苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色 行为学评价之后，每组取10只大鼠进行海马组织HE染色。使用4%多聚甲醛心脏灌流法内部去血固定大鼠脑组织，开颅取脑，石蜡包埋，冠状切片。取海马组织切片进行HE染色，显微镜下观察海马组织病理变化。
8. 统计学方法 所有数据的统计学处理均在SPSS 19.0软件包上进行。计量资料以x-±s表示，组内比较使用配对t检验，组间比较使用方差分析。计数资料采用构成比，组间比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
讨论
抑郁症作为一种多因素引起的精神疾病，与HPA轴功能失调有关，而以HPA轴为靶点的药物能够起到治疗抑郁症的作用。近年来，采用中医温阳解郁理论治疗抑郁症的研究屡见报道。中医理论强调“阳主动”，肾阳作为一身元阳之根，主宰身之阳气，而抑郁症临床总体以情绪低落、思维迟缓、主动性下降等“不动”表现为主，因此阳气不足与抑郁症发病存在密切关系。《素问·生气通天论》曰：“阳气者，若天与日，失其所折寿而不彰，故天运当以日光明”，“阳气者，精则养神，柔则养筋”。强调了人体生命活动均有赖于阳气的推动和温煦作用，使人体阴阳相对平衡协调。温阳解郁汤由郑钦安《医法圆通》之补坎益离丹化裁而来，方中“附子辛热，能补坎中真阳，真阳为君火之种，补真火即是补君火也”，同时上助心阳、中温脾阳；桂枝、生姜辛通心阳，疏肝气，温肝阳，补肝用；炙甘草、大枣甘缓其中，合辛甘化阳、酸甘化阴之意，同时“甘草补中有引火归根之妙”，生姜、大枣温中焦，助脾阳，乌梅统领阳药入肝，温补肝阳，使肝中阳气得以升发，又可敛肝气、养肝血以柔肝，正合肝“体阴而用阳”的生理特性。诸药合用，复肾阳、补肝阳、暖心阳、运脾阳，收纳微阳于肾，伏虚火于中，切合抑郁症之病机。
本研究中构建的CUMS动物模型能够表现出与抑郁症患者相似的行为和激素水平的改变。采用FST、TST和OFT进行本方对大鼠行为影响的评价，结果显示：模型对照组大鼠FST、TST不动时间延长，OFT穿格次数减少，与Cheng R F等研究结果相符；灌胃温阳解郁汤浓缩煎剂后CUMS大鼠的行为迟滞现象得到改善，提示本研究选用的温阳解郁方剂能够起到缓解CUMS大鼠应急抑郁症状的作用。
本研究亦对HPA轴相关激素表达和分泌水平进行检测，HPA轴由下丘脑、腺垂体和肾上腺皮质及其分泌的CRH、ACTH和CORT组成，当机体处于应激状态时，HPA轴处于亢奋状态，其中CORT发挥调节机体应对应激的作用，CORT同时作用于下丘脑和海马的GR，下调CRH的分泌，从而下调HPA轴整体激素水平，使之恢复到基础状态。长期的慢性应激状态下，过量CORT持续刺激GR，使GR与CORT结合能力下降，负反馈调节能力下降，导致HPA轴持续兴奋。此外，持续高水平的CORT会导致海马神经元受损。研究显示：温阳解郁汤能够下调CRH、ACTH和CORT的水平，减少应激时高糖皮质激素对大脑的损害效应，提示该方剂可能通过调节HPA轴发挥抗抑郁作用。另外，该方剂能够恢复抑郁大鼠海马GR表达水平，提示该方剂通过保护海马进而稳定HPA轴负反馈调节功能，这与岳广欣等的研究结果相符。作为情感调节中枢重要的组成部分，其组织功能受损就可能引发抑郁症。本研究中，海马组织HE染色结果显示：温阳解郁汤浓缩煎剂在下调HPA轴激素水平的同时能够起到保护海马组织的作用。因此，温阳解郁汤改善抑郁症状可能与保护海马组织负反馈调节HPA轴能力，下调HPA轴激素水平有关，其机制还有待进一步研究。
