电转化流程
电转化流程适用于（1）转基因（2）基因介导（3）基因修复。
| 实验方法原理 | 胞电转染（电转），也叫细胞电穿孔 (electroporation)，是把外源大分子物质DNA、RNA、siRNA、蛋白质等以及一些小分子导入细胞膜内部的重要方法。 在瞬间强大电场的作用下，溶液中细胞的细胞膜具有了一定的通透性，带电的外源物质以类似电泳的方式进入细胞膜。由于细胞膜磷脂双分子层的电阻很大，细胞外部电流场产生的细胞两极电压都被细胞膜承受，细胞质内分到的电压可以忽略不计，细胞质内部几乎没有电流，因此也决定了正常范围内的电转过程中细胞毒性很小。电场使DNA等物质进入细胞膜后只能停止在细胞膜附近，随后细胞本身的机制可以允许这些物质到细胞核等处。 普通电转能量过高可导致部分细胞因膜破坏而死亡，其中能存活下来的细胞内部都不会受到电流影响，因为细胞膜完整是细胞存活的必要条件。 由于电转技术依靠的是物理方法，细胞表面的分子特性对电转影响比较小。相比化学转染方法和病毒载体转染方法，电转可以用在所有的细胞种类上，而且容易定量控制。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、电转化感受态细胞的制备 1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。 5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。 6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 二、连接产物纯化 1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10μl of ddH2O 2μl of 3M NaAC（PH5.2） 50μl of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物； 4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5.4℃，top Speed离心5分钟； 6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用； 三、电转化 1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻； 2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。 3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。 4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。 5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部； 6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 7．37℃，220－250rpm复苏1小时。 8. 取20μl转化产物加160μlSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。 四、电击杯清洗流程 1.用清水将电击杯稍冲一下。 2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。 3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。 4.加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。 5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。 |
| 注意事项 | 1. 每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 2. 不同样品使用的电机杯应分开。 3.每周用1%酒精浸泡30分钟。 |
| 其他 | 1. 选择合适的电场强度合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞的选择用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA. 3. 质粒的质量应选择纯度高的质粒，首先DNA／RNA应该超纯（A260／A280>1.8），其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。另外，DNA浓度不宜过高。 4. 选择合适的电转染试剂电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，可将电击对细胞的损伤降到最低。并且，Entranster-E可适用于lonza、Bio-rad、BTX等多种电转仪。 |
