淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型（一）
【摘要】 目的 观察β淀粉样蛋白(Aβ) 脑室内注射建立阿尔茨海默病(AD) 大鼠模型及其对大鼠行为、胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性、细胞凋亡、神经生长因子(NGF) 水平等影响。方法 将Aβ1242 注射入大鼠侧脑室,于第1 周、2 周、4 周观察Morris 水迷宫逃避潜伏期、测定脑内ChAT 活性、进行原位末端标记凋亡染色及NGF 免疫组化染色。结果 Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期延长,4 周时更明显。2 周后海马、皮层ChAT 活性下降,4 周后脑内ChAT 活性广泛下降,以海马最为显著。2 周后基底前脑Meynert核区凋亡细胞较其他脑区增多,NGF 阳性细胞明显减少。结论 Aβ脑室内注射可以模拟AD 行为改变,使脑内ChAT 活性降低,基底前脑NGF 含量减少,胆碱能神经元凋亡,可以作为AD 研究模型。
【关键词】 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 胆碱乙酰转移酶 神经生长因子
【中图分类号】 R749. 1 【文献标识码】 A
阿尔茨海默病(Alzheimer Disease , AD) 发病的中心环节是β淀粉样蛋白(β2amyloid protein ,Aβ) 在脑中的沉积[1 ] ,多种神经元尤其是胆碱能神经元原发性变性,脑内胆碱乙酰转移酶(cholineacetyl transferase ,ChAT) 活性下降,是AD 的标志性生化改变[2 ] 。AD 等神经系统变性疾病与细胞凋亡的发生密切相关[3 ] ,而神经生长因子(nerve growth factor ,NGF) 是中枢胆碱能系统重要的神经营养因子,具有明显的抗凋亡作用[4 ] 。
AD 基础研究和药物开发的最大障碍是缺乏一种与AD 病理、生化、和行为等改变相似的理想动物模型。本实验通过Aβ脑室内注射建立AD 大鼠模型,观察大鼠行为学改变、脑内各部位ChAT 活性变化、神经元凋亡情况,以及NGF 水平改变,为进一步的AD 治疗研究提供动物模型。
1 材料与方法
111 动物分组及Aβ脑室内注射 雄性Wistar 大鼠48 只,体重260～300 g ,随机分为4 组:对照组、Αβ注射后7 天组、14 天组、28 天组,每组12 只。大鼠麻醉后用微量注射器缓慢将药物注入右侧脑室(前囱后018 mm ,中线旁开111 mm ,深度316 mm) 。Aβ模型组注射Aβ1242 (购自美国AnaSpec 公司) ,每次7 μg ,连续3天,对照组注射生理盐水,每次7μL ,连续3 天。
112 Morris 水迷宫试验 参照文献方法[5 ] ,记录大鼠找到平台所需逃避潜伏期。各实验组分别于最后1 次药物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 进行试验,对照组同时试验。
113 取材 Aβ注射组分别于最后1 次药物注射后第7 天、14天、28 天宰杀取材,对照组于最后1 次药物注射后28 天取材。每组取6 只快速断头取脑,立即冻于液氮中,待测ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚甲醛溶液中固定72小时以上,进行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫组化染色。
114 ChAT活性检测及定量分析 液氮中冻存脑组织分别取海马、基底节、额叶、顶叶皮层制备5 %(V/ W) 脑组织匀浆, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 总反应体积中,含试样液或空白对照液20μL ,1114 g/ L 乙酰辅酶A(Sigma 公司) 10μL ,70 mmol/L 胆碱(Sigma 公司) 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明(Sigma 公司) 7μL ,3 mmol/ L 氯化钠7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰辅酶A 10μL ,在液体闪烁仪上测定每分钟衰变数(cpm) 。以对照组各部位衰变数为100 % ,计算各组各部位ChAT 相对活性。
115 TUNEL 凋亡染色及半定量分析 选取基底节、海马、额叶、顶叶同时存在矢状断面切片,按TUNEL 凋亡染色试剂盒(武汉博士德公司) 说明书操作,进行TUNEL 细胞凋亡染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一切片高倍视野(400 ×) 下每部位取4 个视野共计数100 个神经元,计算凋亡神经元阳性百分率,即神经元凋亡指数(NAI) 。
116 NGF 免疫组化染色及图像分析 取上述石蜡切片,按NGF免疫组化试剂盒(武汉博士德公司) 说明书操作染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一染色片高倍视野(400 ×) 下取5 个视野,用美国UIC 公司Metamorph Image System V416 图像分析软件得出阳性染色细胞平均灰度值(Average gray value Average) 。
117 统计学分析 计量资料用均数±标准差( x ±s) 表示,各组间ChAT 活性、水迷宫试验潜伏期、NGF 阳性神经元平均灰度值比较采用t 检验,神经元凋亡指数组间比较采用χ2 检验。
