酶免疫技术抗体的酶标记方法
用于酶免疫技术的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。目前酶免疫技术检测中常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶的比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP 广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP 由多个同工酶组成,分子量为40000,等电点为 pH 3～9,酶催化的最适 pH 因供氢体不同而稍有差异,但多在 pH 为5左右。酶溶于水和58%以下饱和度的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白的最大吸收光谱分别为 403nm 和 275nm。一般以OD403nm 与 OD275nm 的比值 RZ(德文 Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶 RZ 值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ 值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后 RZ 值仍可不变。对于制备 HRP 结合物,可用戊二醛两步法和过碘酸盐法。
1、戊二醛法
戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。戊二醛交联法有一步法和两步法之分。一步交联法是把一定量的酶、抗体、戊二醛同时加入到溶液中,在一定温度下反应一段时间,然后用透析法或凝胶过滤法除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。在蛋白质与戊二醛交联反应中,蛋白质赖氨酸基团是戊二醛最可能反应的部位,组成辣根过氧化物酶的300多个氨基酸中只有6个赖氨酸。市售的 HRP 中,只有1～2个赖氨酸基团可供交联,而抗体分子中,赖氨酸基团的含量要大得多,因此,在一步交联中,HRP 的反应性不强,抗体分子在戊二醛作用下形成聚合物,因此交联反应后,必须用50%的饱和硫酸铵沉淀或用凝胶过滤除去聚合物。一步法酶结合物的产率仅6%～7%,其中 HRP 约占5%。在正常情况下,HRP 只有一个戊二醛分子的一个醛基反应,而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应,即不发生聚合,故可将戊二醛先与 HRP 反应。产生的酶结合物中,其酶和抗体的物质的量的比接近1∶1,标记活性的损失比一步法少,但该法的效率也不高,仅有2%～5%的 HRP 标记在抗体分子上,标记的抗体只占25%,酶结合物的产率仅为10%～15%。在实际运用中,酶与抗体的物质的量的比在1～2之间为宜,但未标记的抗体严重干扰检测结果,常用聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶过滤法除去未标记的抗体。
2、过碘酸盐氧化法
该法只用于 HRP 的交联。该酶含18%的糖类,过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠(NaBH4)中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼,可与蛋白质结合,形成按物质的量比例结合的酶标结合物。该法的交联效果比戊二醛法好,结合物中 HRP 与抗体的物质的量的比在2～3之间,参与酶结合物中的HRP 可达70%,而抗体则可达99%。但是在标记过程中,酶活性和抗体的免疫活性损失较多。
