非标记抗体免疫酶组织化学实验——酶桥法
由于在酶标记抗体过程中，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。为了避免酶标记抗体法的上述缺点，Sternberger（1969）在酶标抗体法的基础上，创建了非标记抗体免疫酶技术。该方法先用酶（HRP 或 AKP）去免疫动物（羊、兔和鼠等），使其产生高效价、特异性的抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如 PAP（HRP）、APAAP（AKP）、OAGO（GO）复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键的标记，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。该技术主要有酶桥法和过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）复合物法，以及一些变型的方法。特别是 PAP 法大大提高了检测的敏感性，且染色背景轻，稳定性好，得到了广泛应用。
| 实验方法原理 | 首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作「桥梁」，将它们连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的定位。 其基本流程为：抗原+特异性抗体 → 第二抗体（桥抗）→ 抗 HRP 抗体 → HRP → DAB+H2O2（显色）。 因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的，与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点，能与抗酶抗体结合，所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中，酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的，从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害，提高了方法的敏感性，降低了非特异性染色。染色原理见图 4-7。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min，PBS 洗 3 min × 3 次。 2. 滴加 0.3% H2O2 甲醇液，室温处理 20 min，PBS 洗 3 min × 3 次（抑内源性过氧化物酶活性）。 3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR（只限于石蜡片），PBS 洗 3 min × 3 次。 4. 滴加 1:（5～20）正常羊血清或牛血清 20 min（室温或37℃），吸去多余血清，不洗。 5. 适当稀释的特异性一抗（例如来自种属 A）37℃ 孵育 60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 × 3 min。 6. 第二抗体（也称桥抗体，抗种属 A 的 IgG 抗体）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 7. 抗酶抗体（来自种属 A）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 8. 酶（HRP 70～100 μg/ml，PBS 溶解）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 9. 0.04% DAB + 0.03% H2O2 显色 8～12 min，最好在光镜下控制。 10. 充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化 15～30 s。 11. 常规树胶封片，结果观察。 展开 |
