基因编辑进展梳理 Part I CRISPR系统拓展及机制研究（一）
基因编辑技术是指对目标基因进行编辑，实现对特定DNA片段的敲除、插入等。自CRISPR/Cas9基因编辑技术问世以来，取得了一系列重大突破，并相继在2012、2013、2015和2017年被Science杂志评为十大科学进展之一。因此，CRISPR/Cas9以其操作简便和成本低廉等优势受到了众多研究者和投资者的青睐。
如下图所示：从2011到2018年，NIH对CRISPR相关研究的资助从500多万美元快速增长到11亿美元，而且CRISPR相关科学出版物的数量也从最初的87篇急剧增长到3917篇，这些数据反映了CRISPR /Cas9的巨大潜在价值。
图1. 2011-2018年期间CRISPR研究经费（左）及出版物数量逐年上升（右）（来源NIH）
2018年，CRISPR系统继续发力，在多个领域取得突破性的进展，本期我们就先从CRISPR系统开发及机制研究方面来梳理一下相关的重大事件。
一、新型CRISPR系统继续拓展基因组编辑范围
自2013年最早公布的spCas9以来[1]，科学家一直致力于在复杂的细菌群体中寻找更多Cas9的同系物来拓展基因编辑工具文库，以克服现有Cas9系统存在的诸多问题，比如组分太大无法包装入AAV（腺相关病毒载体）、PAM无法覆盖整个基因组等等。随着saCas9，Cpf1和Cas13等相继问世（如图），新型基因编辑系统被发现除了编辑DNA，逐渐开始具有编辑RNA以及单双链核苷酸等更多功能，这些新系统的发现不仅拓展了CRISPR的编辑范围，还延伸了其在诸多领域中的应用。2018年，又有更多有潜力的CRISPR系统相继被科学家们鉴定并改造。
图2. 近年来被报道出的 Cas9同系物
CasRx：更强版本的Cas13系统
2017年底张锋团队首次报道发现Cas13系统，确认了其可以靶向哺乳动物细胞中的RNA[2]。
2018年3月15日，Salk研究所的Konermann等人为Cas13家族再添一名新成员：Cas13d。这是一种来自肠道细菌（黄化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系统，被命名为CasRx。同Cas13类似，CasRx能够特异性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同时CasRx介导的敲低效果相对于其他RNA调控方法具有更高的效率和特异性[3]。
2. 环状核酸酶（ring nuclease）：病毒防御状态的终止“开关”
III型效应复合物最近被证明可结合入侵病毒的遗传物质形成一种环状寡腺苷酸，俗称第二信使，这一分子会通过CRISPR相关的Rossman折叠结构域结合并激活核糖核酸酶和其他因子来抵抗病毒的入侵，使细胞进入抗病毒状态。然而这种状态的持续激活对细胞是不利的，研究人员推测可能存在某种机制，在病毒被清除后关闭这种状态。2018年9月19日，Malcolm White团队证实了这一机制，一种被称为环状核酸酶的蛋白可特异性地切割环装寡腺苷酸，从而终止抗病毒状态。环状核酸酶的鉴定增加了人们对CRISPR系统的理解 [4]。
3. Cas14: 目前最小型Cas蛋白，为疾病诊断又添一利器
2018年10月18日，Jenifer Doudna团队发现了迄今为止最小的功能性CRISPR系统---Cas14上。Cas14只有400-700个氨基酸，但它同Cas12和Cas13一样，能够靶向切割单链DNA ( ssDNA )，且没有限制性序列要求，因而会盲目地切割细胞内所有的ssDNA。这一特性使得高保真单核苷酸多态性基因分型成为可能。通过进一步的改进，可以为目前已有的诊断系统（DETECTR）提供更多的选择[5]。
4. Cas12蛋白新组员，进一步拓展CRISPR系统的工具箱
Cas12a（Cpf1）同SpCas9已被作为最为常用的CRISPR-Cas基因编辑工具，并成功应用于基因组工程的各个领域。相比SpCas9，Cas12a以其较小的体积（1228bp）和仅需单个RNA的引导等优势被广泛研究和使用[6]。2018年12月6日来自美国Arbor Biotechnologies的研究人员发现了一组新的Cas12蛋白成员：Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i。其中的Cas12c、Cas12h和Cas12i具有RNA导向的双链DNA切割活性，还发现Cas12i在CRISPR的crRNA间隔区的互补链和非互补链上表现出明显的切割效率差异，这导致dsDNA形成的主要是单链切口（nicking）。Cas12g则主要以核糖核酸酶的形式，通过RNA靶向切割单链RNA和单链DNA。这项研究揭示了V型CRISPR-Cas系统在不同路线进化中的功能多样性，同时进一步扩展了CRISPR工具箱的运用范畴[7]。
二、工程化CRISPR系统拓展基因组应用范围
尽管CRISPR-Cas9系统被广泛用于基因组编辑，但Cas9可以识别的序列范围受到特定原间隔基相邻基序(
PAM)需求的限制，因此通常很难实现高精度靶向双链DNA断裂的基因组编辑应用，这包括目前热门的单碱基编辑和基于CRISPR的基因筛选等技术。随着Cas9蛋白组学的深入研究，通过人为引入随机突变来改变PAM特异性的Cas9衍生物使突破这一限制成为可能。目前，科学家主要通过结构信息、基于定向进化的细菌选择系统来识别不同PAM序列的Cas9功能突变体，这些Cas9突变体具有与野生型SpCas9相当的编辑能力和特异性。这一技术为寻找高精度的Cas9突变体提供了研究方向，极大地拓展了CRISPR系统工具包，为实现CRISPR系统全基因组编辑打开了大门[8]。
建立新型细菌防御系统筛选系统，开发更多具有潜在价值的分子工具
2018年1月25日，来自以色列魏茨曼科学研究所的Rotem Sorek团队在Science上发文，通过构建出一种扫描所有细菌基因组的计算机程序来研究更多的防御系统基因，将合成的多基因系统插入到天然免疫系统已被灭活的细菌中，通过噬菌体和其他感染因子的筛选，发现细菌存在10种之前未知的细菌免疫防御机制。这些新型防御系统中的任何一种都有可能成为下一种基因编辑工具 [9]。
2. xCas9: 一种能够识别多种PAM序列的SpCas9突变体
2018年2月28日，David Liu团队在Nature期刊上发文，他们利用一种噬菌体辅助的连续进化系统 ( PACE )
进化出一种能够识别多种PAM序列的SpCas9变体( xCas9
)。xCas9的PAM相容性是迄今为止在所有Cas9识别范围的哺乳动物中最为广泛的，并可以应用于人类细胞中，包括靶向转录激活、核酸酶介导的基因敲除，单碱基编辑等。值得注意的是，尽管xCas9的PAM兼容性有所扩大，但它的DNA特异性要比SpCas9高得多，在NGG
PAMs和非NGG PAMs靶位点中全基因组的脱靶效应也都比spCas9低得多。其中最佳的xCas9
PAMs为NGN，占约四分之一的人类基因组。xCas9的出现极大地扩展了CRISPR系统的DNA靶向范围，使CRISPR系统变得更加精确和灵活[10]。
图3. PACE-噬菌体辅助连续进化器模式图[10]
3. SpCas9-NG：一种识别“NG”PAM序列的Cas9
2018年9月21日，Osamu Nureki团队通过合理的设计，开发了一种识别NG而不是NGG的SpCas9突变体（SpCas9-NG）。SpCas9-NG增加了靶向范围，且具有与野生型SpCas9相似的特异性，还可以与其他编辑器（胞苷脱氨酶）一起使用。因此，SpCas9-NG有效地补充了CRISPR工具箱，将在从基础研究到临床治疗等广泛应用中发挥重要的作用[11]。
4. ScCas9: 利用生物信息学发现的PAM仅含一个“G”的Cas9
2018年10月24日，来自美国麻省理工学院的研究人员构建了一个自动化的生物信息学管道，通过目标比对搜索PAMs ( SPAMALOT )，进一步探索了被忽略的Cas9链球菌直形菌株的微生物PAM多样性，发现了一种来自犬链球菌的Cas9（ScCas9），展示了其在细菌和人类细胞中的精确编辑能力。ScCas9的 PAM序列为5’-NNGTT-3’，且仅含一个碱基G，因此能靶向SpCas9不能的靶DNA序列且位点更多。ScCas9即可作为替代的基因组编辑工具，也可作为发现新的链球菌PAM特异性的功能平台[12]。
三、CRISPR系统核酸酶作用机制研究取得阶段性进展
Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的一类核酸酶，目前已鉴定出至少45个Cas蛋白家族。研究人员已通过冷冻电镜技术来解析其蛋白结构以及作用机制，为认识基因编辑系统的应用以及改造CRISPR系统提供了基本的结构和理论基础[13]。现在，各种新型Cas蛋白被陆续发现和解析，这将为开发新型CRISPR系统以及在将来高效地运用于基因治疗奠定基础。
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