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密度梯度离心基础知识（三）

2020.7.14

●等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic）
等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。要做到等速沉降，必须使梯度液密度和粘性力的增加与沿着离心半径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离心力，以及颗粒本身的沉降系数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降系数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。
在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。为了构造等速沉降梯度我们必须注意到转头、离心管，梯度介质的密度、浓度和粘性系数在同一温度。
在甩平转头中作蛋白质分离常用 5~20%（W/V）蔗糖梯度在 5℃离心可以达到近似的等速沉降的效果，而 10~30%（W/V）的甘油梯度在 5℃时 DNA或 RNA也可以达到近似等速沉降的目的，其他大多数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。
●凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度：
为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常希望梯度曲线在近液面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与此相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故考虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度便能满足这个要求。
●复合型梯度：
如果用程序梯度仪来准备梯度，那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中，这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也可以制备其他类型的复合梯度。一般说，复合梯度多用于区带离心。

2、等密度离心，梯度要素的选择
（1）梯度材料及梯度溶液选择
所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂，缓冲剂的组成及 PH值取决于生物样品的性质。对细胞、亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。
常用于等密度离心梯度材料有：

材料名称	DNA	RNA	核蛋白	膜	亚细胞器	细胞	病毒
蔗糖	不适合	不适合	可用	较好	较好	可用	较好
Ficoll	不适合	不适合	不适合	可用	可用	昀佳	较好
CSCL	昀佳	较好	昀佳	不适合	不适合	不适合	较好
Percoll	不适合	不适合	不适合	可用	较好	较好	可用
Nycodez	可用	可用	昀佳	昀佳	昀佳	较好	较好

从上表可以看出，对 R-Z离心，蔗糖是很好的梯度材料，而对于等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。
（2）梯度型式选择
离心时，溶液中的各组组份都同时处在离心场中，被分离的组份及梯度材料的分子都在离心力作用下向离心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、区带转头、连续流转头）沉降。对于梯度材料，如果它们的沉降速度在离心初始阶段远大于浓度扩散速度，那么就可以形成连续的密度梯度。这就是“自形成梯度”产生的基本原理。我们可以把被分离样品和梯度材料混合在一起离心，梯度材料在离心过程中形成密度梯度，而样品中不同组份则沉降（或上浮）到它们自己的等密度区。
另一种方法是预先制备好密度梯度，将样品铺在离心管（或区带转头）的某一部份（如离心管上部、下部或中部）离心，使样品中各种组份沉降（或上浮）到它们自己的等密度区前后，从而达到了我们所需要的“平衡”结果。
预先形成梯度可以是不连续的（阶梯型），也可以是连续梯度。阶梯型不连续梯度大多适用于从植物或动物组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。而连续梯度由于其密度平滑地变化，对于某些生物样品的多种成份组合的分离可以得到较高的分辨率因而得到了广泛的应用。
选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。某些胶体硅材料可在10,000~20,000×g的离心场中离心30分钟就可以自形成梯度（例如美国 Dupont公司的 Ludox及瑞典 pharmarcia公司的 Percoll）。但对某一些材料，自形成梯度的时间很长，对离心力的要求也很高。CSCL或 Metrizamide需要在50,000~500,000×g的离心场中离心数小时甚至数十小时才能自形成梯度（如用CSCL做质粒 DNA分离，梯度液中加 E.B.和 Triton x-100，在 490,000×g需要离心4小时，才能利用CSCL的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。）
预形成梯度的主要优点是离心时间较短，因为我们只要考虑样品中某个组份到达其等密。
预形成梯度的缺点是：
●被分离样品的容量较少（与自形成梯度相比）
●对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结从而减少了样品回手率甚至影响纯度。
●预先制备梯度液需较长时间，亦较繁复。
与预形成梯度相比较，自形成梯度有较大样品容积（特别是使用垂直剖面积较大的垂直管或近垂直离心这个优点更突出）；可以简单地调整初始密度；离心过程中样品既有上浮又有沉降，也就是混在梯度液中的样品在离心过程中，在梯度材料自形成梯度的同时从离心力的正反二个方向向自己的等密度区靠拢，最后排列在自己的等密度区上下形成纯样品区带。从这个意义上说，样品是真正到达了自己的等密度取而具有很高的浓度。
自形成梯度的等密度离心又称平衡等密度离心（Eguilibrium-Isopycnic）
（3）自形成梯度
综上所述，某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度， Ludox，Percoll中的胶体硅颗粒可以较快地向离心管管底（如甩平转头等）或外侧（垂直管转头）沉降而另一些材料如 CSCL，CS2SO4，Metrizamide等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就特别长。平衡后梯度曲线的形状不仅依赖于梯度材料本身，也取决于其他一些离心条件。自形成梯度的最基本条件是样品中需要分离的各种组份在分离后都就包含在梯度范围中。最佳的自行梯度形状还应该使被分离组份都处在各自的较窄的纯样品区带内，只有这样才能得到较高的分辨率。使很多单一组份在尺寸和密度上都有差异，这就使得同种样品区带离心后显得比较宽。为了提高分辨率就必须使梯度曲线变得陡一些，但要随心所欲做到这一点却很困难。
幸运的是对于所有梯度材料，计算自形成梯度的公式（也就是自形成梯度曲线的形成原理）是一样的。由于 CSCL分离质粒DNA已有近 30年的历史，大多数定量分析工作集中于讨论CSCL梯度。用下面的一些公式可以计算自形成梯度曲线的形状，可用于设计最合适的密度梯度。
●梯度曲线的斜率：
密度梯度曲线中某一点的昀终斜率可以用dρ/dr下式计算：

其中：ω是弧度（弧度/秒）
r：从旋转中心到计算点的距离（cm）
β°：梯度材料的密度梯度比例常数。
β°的数值请参考：
（1）余兴明“质粒 DNA的超速离心分离”或
（2）J.B.Martin “Biopolymers”9，1970，P597