PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)实验
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的制作是分层进行的，因此凝胶不仅有分子筛效应，还具有浓缩效应。和琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶难于制备和处理。它们的分离范围较窄。但是它们也有突出的优点，由于是不连续的 pH 梯度，故样品被压缩成一条狭窄的区带，因而增强了分离效果，提高电泳分辨率。尤其对小DNA 片段的分析(5～500bp)。在这一范围内，仅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分开。其次，DNA 纯度很高。从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA 纯度很高以致于下步操作不用任何处理。还有，它的负载容量高。该胶的标准加样槽中可以加入高达10mL 的DNA 样品，而不影响电泳分辨率。多应用于分离纯化和鉴定大小为5～500bp 的DNA 片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种，前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH 值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH 值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH 值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。以下主要介绍连续体系。
【仪器、材料与试剂】
1.30% 的丙烯酰胺/N,N＇—甲基双丙烯酰胺(Acr/Bis)：29g 的丙烯酰胺，1g 的N,N＇—甲基双丙烯酰胺，加蒸馏水至100mL。
2.10% 过硫酸铵(Aps)：0.4g 过硫酸铵，4mL 蒸馏水，TEMED(N,N,N＇,N＇—四甲基乙二胺)。
3.1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8)：量取3mol/L Tris 母液50mL，用盐酸调节pH
至8.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)；0.5mol/L Tris-HCI(pH6.8)：量取1mol/L Tris
溶液50mL，用盐酸调节pH 至6.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)。
4.10%十二烷基硫酸钠(SDS)(室温存放)。
5.1×TBE 缓冲液：89mol/LTris-硼酸盐，2mol/L EDTA(pH8.0)。
6.I 型加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液(W/V) 4℃贮存。封底胶：1%琼脂糖溶液(用蒸馏水配置)。
7. 染色液：0.2g 考马斯亮蓝R-250、84mL95%乙醇、20mL 冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。
8.脱色液：医用酒精:冰醋酸: 水=4.5:0.5:5(V:V:V)。
9.保存液：7%冰醋酸。
10.玻璃板、隔片、电泳槽、烧杯、磁力搅拌棒、微波炉或加热器、天平、梳子、紫外分析仪、电源等。
【实验步骤】
连续体系
制备100mL 凝胶液；
蒸馏水 37.5mL
微波炉加热30s，搅拌棒搅拌
尿素 50g
10×TBE 缓冲液 8mL
30%丙烯酰胺 10mL
倒胶之前
10%过硫酸铵 0.8mL
TEMED 23.5μL
2.用去污剂清洗一长一短两块玻璃板以及插入两板间的间隔片，然后用乙醇擦干。
3.将长短两板一边对齐，插入大约1.5cm 宽的间隔片，用夹子将玻璃板三面夹紧。用封底胶(1%琼脂糖溶液)将胶板的三面封好。
4.加10%过硫酸铵和TEMED 于胶溶液中混匀，立即灌胶。为了避免产生气泡，灌胶时应小心缓慢。如有气泡产生，用橡皮锤或铅笔头从下至上轻敲胶板将气泡赶出。
5. 加至距短玻璃板上缘约0.5cm 时，停止加胶。轻轻插入大小合适的梳子，此时不要让梳子下面产生气泡，夹紧梳子和胶板，再把剩下的胶液加到梳子两侧。
6. 室温凝聚时间约为0.5～1h。
7.小心移去梳子，用水清洗加样孔，把胶固定于电泳槽上，加入1×TBE 缓冲液。
8.取DNA 样品和6 倍I 型加样缓冲液混匀。每孔加3～5/μL 该混合液。电泳时电压梯度为1V/cm 到8V/cm。
9.电泳完毕后，取出胶并将其放在EB 中染色30min。EB 浓度为(0.5μg/mL 1 倍的TBE 缓冲液)。
10. 紫外光下分析、拍照。
(不连续体系主要是用于分析蛋白质，过程可见第三章，故在此不于介绍。)
【注意事项】
制备凝胶应选用高纯度试剂，否则影响凝胶凝固和电泳效果。Acr 和Bis 均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应带手套和口罩，纯化应在通风橱中进行。
2. 勿用手接触灌胶面的玻璃，以防凝胶板和玻璃板剥离，产生气泡和滑胶，或者剥胶时凝胶板易断裂。故所用器材均应严格清洗。
3.用琼脂糖封底及灌胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
4.为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量降低。含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。
5. 凝胶完全凝固后，必须放置30min 左右，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品梳，切勿破坏加样孔底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
