组织溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检...（二）
三、标准样品配制
准备好4个1.5毫升离心管，标记为1至4号管
分别加入200微升稀释液（Reagent E）到2至4号管
移取400微升标准液（Reagent H）到1号管
小心移取200微升1号管的标准液（Reagent H）到2号管，混匀
小心移取200微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀
将1至4号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | 稀释液（Reagent E） | 标准液（Reagent H） | 测定体系标准油酸浓度 |
1 | － | 400微升 | 2毫摩尔/升 |
2 | 200微升 | 200微升1号管 | 1毫摩尔/升 |
3 | 200微升 | 200微升2号管 | 0.5毫摩尔/升 |
4 | 200微升 | 0 | 0 |
标准曲线测定
移取900微升稀释液（Reagent E）到2毫升离心管
加入100微升上述配制的标准液（Reagent H）
加入200微升显色液（Reagent F）
涡旋震荡60秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g
小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
重复实验步骤1至7四次
构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准油酸浓度（毫摩尔/升）
背景对照测定
移取800微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管
加入100微升底物液（Reagent D）
加入100微升稀释液（Reagent E）
涡旋震荡60秒
37℃温度下孵育30分钟
移取100微升到新的2毫升离心管
加入1毫升稀释液（Reagent E）
加入200微升显色液（Reagent F）
涡旋震荡60秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g
小心移取1毫升上层液相到新的比色皿
即刻放进分光光度仪检测：获得背景吸光读数
六、样品总活性测定
移取800微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管
加入100微升底物液（Reagent D）
加入100微升上述制备的待测样品（50微克样品蛋白）
涡旋震荡60秒
37℃温度下孵育30分钟
移取100微升到新的2毫升离心管
加入1毫升稀释液（Reagent E）
加入200微升显色液（Reagent F）
涡旋震荡60秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g
小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿
即刻放进分光光度仪检测：获得样品吸光读数
实际吸光读数：样品吸光读数—背景吸光读数
根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）
样品非特异活性测定
移取750微升缓冲液（Reagent C）到2毫升离心管
加入100微升底物液（Reagent D）
加入50微升专性液（Reagent G）
加入100微升上述制备的待测样品（50微克样品蛋白）
涡旋震荡60秒
37℃温度下孵育30分钟
移取100微升到新的2毫升离心管
加入1毫升稀释液（Reagent E）
加入200微升显色液（Reagent F）
涡旋震荡60秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g
小心移取1毫升蓝绿色上层液相到新的比色皿
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
实际吸光读数：样品吸光读数—背景吸光读数
根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）
计算样品活性
样品总活性和非特异活性计算
[根据标准曲线获得样品对应油酸浓度（毫摩尔/升）X 10（稀释倍数）X 1（反应体系容量；毫升）]÷[ 0.1（样品容量；毫升）X 30（反应时间；分钟）]＝微摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔/毫克/分钟
样品特异活性计算
样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性
注意事项
本产品为20次操作，包括背景对照
操作时，须戴手套
系统操作过程中，背景测定只需1次
样品须澄清，至关重要
如果底物液（Reagent D）粘稠，加热孵育后呈现乳白色液体，即可使用
比色测定后，比色皿须清洗彻底
样本读数高于背景读数表明具有酶活性
建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
溶酶体酸性脂酶单位活性定义为：在37℃，pH 5.0条件下，每分钟内能够释放1微摩尔游离脂肪酸所需的酶量作为一个活性单位
本公司提供系列细胞脂类酶学检测试剂产品
