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组织溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检...（一）

2020.5.11

组织溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检测试剂盒使用说明

主要用途

组织溶酶体脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过溶酶体脂酶反应系统中，在选择性抑制剂存在与否的情况下，底物胆固醇油酸酯水解后的游离脂肪酸，与醋酸铜反应后的蓝绿色产物，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解样品（动物、人体、昆虫等）溶酶体脂酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

溶酶体酸性脂酶（lysosomal acid lipase；LAL；EC3.1.1.13），又称为酸性胆固醇酯水解酶（acid cholesteryl ester hydrolase），是脂蛋白代谢中的水解酶（hydrolase）之一，含有372氨基酸的糖蛋白，存在于除红细胞外的所有组织细胞中的溶酶体内。在酸性环境下，通过水解胆固醇酯（cholesterol ester）和甘油三酯（triacylglycerols）键，以降解细胞内的脂蛋白，释放出游离脂肪酸，调节细胞内的脂类代谢，尤其是胆固醇合成和甘油三酯代谢。溶酶体脂酶缺陷将导致伍尔曼氏病（Wolman disease）和胆固醇酯储积病（Cholesteryl Ester Storage Disease）。溶酶体脂酶具有治疗动脉粥样硬化（atherosclerosis）和外周血管性疾病的潜力。基于底物胆固醇油酸酯（cholesterol oleate），在溶酶体酸性脂酶特异性抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine）存在与否的情况下，通过溶酶体酸性脂酶的水解催化，产生游离脂肪酸油酸（oleate），继而与生色试剂醋酸铜反应，产生蓝绿色铜盐复合物，在分光光度仪下，其吸光值的变化（715nm 波长），来定量测定溶酶体酸性脂酶的活性。其反应系统为：

lysosomal acid lipase

cholesterol oleate + H2O → cholesterol + oleate

chlorpromazine（+/—）

oleate + cupric acetate/pyridine → cupric salt

产品内容

清理液（Reagent A） 60毫升

裂解液（Reagent B） 20毫升

缓冲液（Reagent C） 50毫升

底物液（Reagent D） 5毫升

稀释液（Reagent E） 50毫升

显色液（Reagent F） 10毫升

专性液（Reagent G） 1毫升

标准液（Reagent H） 1毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，稀释液（Reagent E）和标准液（Reagent H）具有挥发性和毒性，注意密闭瓶盖和操作安全；有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

2毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

样品准备

手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
移入到一个液氮冻存管
即刻放进液氮罐过夜
次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
放进一个15毫升锥形离心管
加入1毫升裂解液（Reagent B），充分混匀
涡旋震荡5秒，充分混匀组织颗粒群
即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
在冰槽里用匀浆棒匀化组织细胞（约20至40下）
将所有组织细胞匀浆物移入1.5毫升离心管
放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为800g
小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管
放进4℃微型离心机离心15分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
加入500微升缓冲液（Reagent C）
强力涡旋震荡15秒
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

测定准备

准备好待测样品（例如组织裂解样品等），置于冰槽里
设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长715nm，使用稀释液（Reagent E）置零
缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

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周锦帆