分支杆菌WhiB6 通过调控ESX-1和Dos调节子肉芽肿形成和毒力
分支杆菌WhiB6可以通过调控ESX-1和Dos 调节子进而调节肉芽肿的形成和毒力
研究背景
结核分枝杆菌是最成功的胞内病原体之一。其在感染宿主时能够被巨噬细胞所吞噬，进而形成吞噬体。吞噬体可以进一步的破坏入侵的病原体。但是结核分枝杆菌可以通过一系列的过程来避免吞噬体的消灭，进而来破坏宿主细胞。
研究思路
研究结果
1、 WhiB6调控与ESX-1分泌系统相关基因的表达
海鱼分枝杆菌的MMAR_5437基因（与结核分枝杆菌的WhiB6同源）保守地存在于ESX-1基因附近。通过比对海鱼分枝杆菌和结核分枝杆菌的ESX-1基因簇发现，其ORF序列和基因结构都是高度保守的 (Figure 1A)。推测WhiB6是否可以调控ESX-1系统的基因表达。RT-PCR结果发现，在WhiB6敲除株中，ESX-1系统相关基因pe35,espE,esxA, 和esxB的表达量都发生了显著的下调（Figure1B）。为了进一步研究WhiB6是否可以调控ESX-1相关基因的表达，作者做了chip实验，结果发现， espA, whiB6, espE,和eccA1基因的启动子区域在野生型Mm(WT)和互补株MB6 中得到了显著的富集（相对于WhiB6突变株和互补空载体株 (Figure 1C)。进一步研究WhiB6是否可以进行自身的调控。WT野生株和WhiB6突变株转入含有分别来自于Mm, MtbH37Rv, 和MtbCDC1551 菌株的融合有egfp荧光标签的WhiB6启动子的质粒。荧光定量结果显示，在Mm和MtbCDC1551菌株荧光强度显著增高，而MtbH37Rv菌株则没有（Figure 1D）。Mm菌株的RT-PCR也同样证实了这个结果（Figure 1E）。
2、 WhiB6 Fe-S 簇对ESX-1的功能起着重要的作用
通过比对Mm菌株和Mtb菌株的WhiB6 蛋白的序列发现，它们具有高度的相似性(Figure 2A)。WhiB6蛋白中的四个保守的Cys残基 (i.e., Mm菌株中的Cys-14, 33, 36,和Mtb菌株中的Cys-34, 53, 56, and 62 inMtb)是非常保守的(Figure 2B)。先前研究发现，ESX-1与溶血相关。因此作者进行了溶血实验。结果发现，WhiB6突变株与野生株相比，溶血性下降 ，而互补株的溶血性又发生恢复。此外，所有对Cys进行突变了的分枝杆菌的溶血性都发生了显著的下降（Figure 2C）。此外， 在WhiB6突变株中，ESAT-6 (EsxA)和CFP-10 (EsxB) 的含量也发生了减少，而在互补株中其含量又得到了恢复（Figure 2D）。同样地，在WhiB6突变株中，ESX-1相关基因的表达量也发生了下降（Figure 2E）。以上这些结果表明，WhiB6的Fe-S对于调控ESX-1是非常重要的。
3、 破坏WhiB6的Fe-S簇可以调控Mm的转录模式（转录组测序及分析由上海伯豪完成）
为了进一步确认MB6和MB6-4CS具有不同生长表型的原因，作者检测了与代谢相关基因的表达情况(Figure 3A)。其中，编码与细胞色素c通路的电子转移链bc1复合物（qcrCAB），aa3型细胞色素c氧化酶（ctaBCDE）和细胞色素bd（cydABCD）的表达量在MB6中显著下调。同样地，编码F0F1 ATP合成酶的基因的表达量也发生了下降。相反，上述基因的大部分的表达量在MB6-4CS中出现了上调(Figure 3A)。有趣的是，与细胞壁合成相关基因操纵子相关的基因的表达量在MB6中出现了显著的下调(Figure 3A)。在MB6-C14S和MB6-4CS中，Dos休眠基因 (i.e., devH(mmar_1515)-devR-devS operon)和hspXandtgs1相对于MB6组都出现了显著的诱导表达 (Figure 3B)。在TB6-C34S和TB6-4CS中也出现了同样的结果。总之,这些研究结果指向一个假肢切换机制，凭借独立于apo-WhiB6之外的WhiB6 Fe-S簇可以调控基因的表达。更特别的是，转录组数据显示，WhiB6 Fe-S 簇可以对dos 调节子进行负调控以及对ESX-1分泌系统进行正调控。
4、 WhiB6 与NO反应后可以动态调控ESX-1和Dos 休眠基因的表达
作者添加EDTA-NO后，可以导致在420nm/480nm的吸光度减少，而在300-320nm处的吸光度增加（Figure 4A）。这个结果表明了DNICs的形成。与大部分WhiB蛋白家族相似，WhiB6同样可以与NO发生反应，进而形成亚硝化 Fe-S簇。为了进一步研究亚硝化WhiB6对ESX-1和DosR表达的调控，作者使用EDTA-NO对MB6, TB6, 和DwhiB6-vec菌株进行不同时间的处理来模拟活化的巨噬细胞的状态，然后观察WhiB6的表达(Figure 4B)。结果发现，NO可以诱导whiB6的表达，而其mRNA水平在处理60min后出现了减少 (Figure 4B)。devH-devR-devS操纵子的第一个基因devH的表达情况在MB6 和TB6中相对于whiB6-vec随着时间的变化出现了增加(Figure 4C)。但是这些差异表达在3小时后逐渐减少(Figure 4C)，表明NO和WhiB6以及DosR之间存在着一个复杂的反应过程。假定esxB是WhiB6调控ESX-1分泌系统中起着决定性作用。作者发现，在TB6 和MB6菌株中esxB基因的表达量在NO处理30分钟后出现了显著被诱导，而在60分钟后出现下降（Figure 4D）。有趣的是，在TB6 和MB6菌株中，NO处理3小时后，esxB被显著的激活 (Figure 4D)。当用300 uM的EDTA-NO处理MB6菌株时，EsxA和EsxB的分泌出现了显著的降低。这个结果表明，NO可以诱导ESX-1分泌系统的下调。
5、 Isoforms of WhiB6 亚型可以调控Mm的毒力以及在斑马鱼中肉芽肿的形成
基于以上实验结果，作者推测，WhiB6可以参与到肉芽肿的形成。为了确认此假设，作者检测了Mm菌株的毒力（5,000 cfu）。结果发现，当斑马鱼感染了MB6和TB6的互补菌株后，他们会出现高的死亡率（Figure 5A），而感染了MB6-4CS 和TB6-4CS却出现了生存率升高的情况。感染了WT, whiB6突变株,和whiB6-vec（突变株+空载体）也有相同生存率。接下来，为了确定这些疾病的死亡是否是由MB6 和MB6-4CS 形成的肉芽肿引起的，作者又检测了肉芽肿的形成动力学。在感染2周后（WT和whiB6突变株），巨噬细胞聚集，肉芽肿出现 (Figures 5B and 5D)。斑马鱼感染4周后，肉芽肿更加丰富， 但是有较少的一致的排列不规则的多中心坏死区 (Figures 5C和5E)。 MB6和TB6 可以加速坏死并且加速破坏肉芽肿(Figures 5G和5J)。相反，空载体组就有排列完好的单一中心的坏死的肉芽肿(Figure 5F)。但是当斑马鱼感染了MB6-4CS和TB6-4CS后，只能观察到很少的肉芽肿，并且只有少数的坏死区(Figures 5H and 5K)。感染4周后, MB6-4CS和TB6-4CS 菌株还能形成排列完好的肉芽肿，并且还有分枝杆菌存在 (Figures 5I 和5L)。实验结果表明，WhiB6不仅能调控分枝杆菌的毒力，还能调控坏死肉芽肿形成的持续时间。
为了研究MB6，MB6-4CS和whiB6突变株（空载体）共感染是否能增加细菌的生存率，以及增加感染的传播，3个菌株被两两结合来进行下一步的研究。当与MB6进行共感染4周后，在斑马鱼的幼体的头部发现了细菌的存在 (Figures 6C and 6D)。相反，同时感染MB6-4CS和whiB6突变株（空载体）的斑马鱼中的几乎50%的头部在感染4周后发现有细菌，但是在7周后没有(Figure 6D)。在MB6-4CS和whiB6突变株（空载体）感染7周后，可以检测到细菌的荧光显著的减少(Figure 6E)。因此，结果表明，WhiB6的压型可以调控毒力和肉芽肿的形成，并且可以调控Mm在斑马鱼中的复制和传播。
总结
WhiB6 可以通过Fe-S簇来差异性的调控ESX-1和DosR调节子。本实验也为研究WhiB6在分枝杆菌的感染，传播和疾病发展中的作用提供了新的思路。
