凝乳酶（curdling enzyme）的提取纯化
一、实验目的
通过发酵液中凝乳酶的提取纯化，了解酶提取纯化的方法，学习凝胶层析法的工作原理和基本操作技术。
二、实验原理
凝乳酶是一种酸性蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切Phe105- Met106连接的κ-酪蛋白，导致牛奶凝结，从而被广泛应用干酪生产中。
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子化合物都能发生沉淀作用。其原理是降低水溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白质分子之间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
凝胶层析法是广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子的分离分析的有效力法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相载体是具有分子筛作用的凝胶。目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)，其它还有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。
Sephadex是由细菌葡聚糖(以右旋葡萄糖为残基的多糖)用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小(交联度大，“网眼”就小)，从而得到各种规格的Sephadex，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。将充分溶胀的凝胶装入层析柱中，再加入样品以后，由于Sephadex的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，比较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层析柱中移动的速度因分子的大小而不同。分子量大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析柱。分子量小的物质可以透入凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比分子量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集流出液，分子量不同的物质便互相分离。SephadexG10到G50通常用于分离肽或脱盐。G75到G200可用于分离分子量大于10000的蛋白质。
三、实验材料与试剂
1. 材料：微生物工程菌株
2. 试剂：土豆、无水乙醇、Na2HPO4﹒12H2O、NaH2PO4﹒2H2O、Sephadex G-100、脱脂奶粉
3. PDA培养基：取去皮土豆200 g，切成黄豆大小的碎块，加蒸馏水500mL
煮沸1 h后，单层纱布过滤，补充蒸馏水至1 L，115oC灭菌 20 min
4. 0.005 mol/L pH 6.2 Na2HPO4-NaH2PO4溶液：准确称量0.2184 g Na2HPO4﹒
12H2O、0.6851 g NaH2PO4﹒2H2O，加水溶解后定容至1L
四、实验仪器
台式离心机、水浴锅、电子天平、铁架台、层析柱、恒流泵、摇瓶、试管、量筒、烧杯、玻璃棒
五、提取工艺流程
1. 分别挑取微生物工程菌株单菌落，接种于4瓶装有50 mL PDA培养基的500 mL 摇瓶中，在30℃、250 r/min 条件下培养约36
h，合并发酵液，3500r/min离心5min，取上清，向其中加入2倍体积的无水乙醇，4℃沉淀30min，8000r/min离心15min，弃上清，将沉淀溶于0.005
mol/L pH 6.2的磷酸盐缓冲液，得到粗酶液。
2. 利用Sephadex G-100纯化粗酶液
(1) Sephadex G-100的预处理
取2.5 g Sephadex G-100，至于烧杯中，加入蒸馏水，轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒，如此反复洗涤几次后，加入过量0.005 mol/L pH 6.2的磷酸盐缓冲液，室温下溶胀72 h。
(2) 装柱
取直径1.0 cm，长50 cm的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5~7 cm的0.005 mol/L pH
6.2的磷酸盐缓冲液，然后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。凝胶缓缓下沉，继续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一层滤纸，避免上样时破坏胶面。用缓冲液平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为12
mL/h。
(3) 上样
将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱凝胶表面。拧开下端的螺旋夹，使样品进入凝胶中，快要进完时，加1~2 mL缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
(4) 洗脱、收集
当样品完全进入凝胶后，用0.005 mol/L pH 6.2的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱速度为12 mL/h，并分管收集，1mL/管，收集80管。
(5) 凝胶柱的重复使用与保存
当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：①在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%
NaN3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4
℃保存。此法至少可以保存半年以上。②用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。③长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
3．测定凝乳酶酶活，绘制纯化曲线。
取5 mL 100 g/L的脱脂乳，在37 ℃保温5 min，加入0.5 mL凝乳酶，混匀，准确记录从加入酶液到乳凝固的时间。把40
min凝固1 mL 100 g/L的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhelt
Unit)，记作U，并以相对活力(Ru)表示各因素的影响效果。
U=2400/T×5/0.5×D
T为凝乳时间(s)；D为稀释倍数。
