NCI-N87 [N87]人胃癌细胞 酵母双杂交实验常见问题
NCI-N87 [N87]人胃癌细胞 酵母双杂交实验常见问题
1.如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？
在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。
NCI-N87 [N87]人胃癌细胞 酵母双杂交实验常见问题2.如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？
该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
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NCI-N87 [N87]人胃癌细胞 酵母双杂交实验常见问题3.转化效率太低怎么办？
可以采用以下方法解决：
1） 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。
2） DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
3） 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。
4） 检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。
4.杂交效率不高，该如何处理？
在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/ml。
一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验
