细胞共定位
实验试剂
高保真聚合酶(pfu ultra)，限制性内切酶(XhoI、SpeI、BamHI、SpeI、SacI)，金粉，无水乙醇，2.5MCaCl2 ，20ul 0.1M亚精胺
实验设备
PCR扩增仪，PDS-1000/He型基因枪，激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 510 )
实验材料
实验步骤
pA7- CFP- AtCOP1，pA7-AtCRY1-YFP
pA7- CFP-OsCOPl，pA7-OsCRY1b-YFP
中间载体pA7-CFP和pA7-YFP为本实验室构建。将AtCOPl(引物为AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物为AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分别用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增，纯化PCR产物，用XhoI/SpeI双酶切后，分别连接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位点上，得到pA7-AtCOP 1-CFP，pA7-AtCRYl-YFP。
将OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3')，纯化PCR产物，用BamHI/SpeI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点中，得到pA7-OsCRYlb-YFP。
将嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3')，纯化PCR产物，用XhoI/SacI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点SalI/SacI中，得到pA7-OsCOPl-CFP。所有克隆经DNA测序正确后使用。
a. 称取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管。
b. 加入1mL(或50uL)无水乙醇，振荡lmin，10,000rpm离心l0s。
c. 弃上清，加入1mL(或50uL)无菌水，振荡lmin，10,000rpm离心l0s。
d. 弃上清，加入1mL(或50uL)无菌水，振荡1 min，-20℃保存。
b. 依次加入5uL质粒DNA (1ug/ul)，50ul 2.5MCaCl2 和20ul 0.1M亚精胺(每加完一样，振荡2-3秒)。
c. 振荡3min，10,000rpm离心10-20秒，弃上清。
d. 加250ul无水乙醇，振荡重悬，10,000rpm离心10-20秒，弃上清。
a. 基因枪轰击的前一天将新鲜洋葱的鳞叶切成小块(3-5cm长宽)，置于MS培养基上培养过夜。
b. 轰击之前将洋葱的内表面朝上，用PDS-1000/He型基因枪将上述质粒轰击入洋葱内表皮，黑暗培养24h。
c. 激光共聚焦显微镜观测(Carl Zeiss LSM 510 )。
