包涵体蛋白的纯化和复性实验过程（二）
A、过柱前的注意事项：
a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；
b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；
c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；
B、过Ni柱的操作步骤：
①用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；
②⑩5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电；
③5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；
④10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；
⑤上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；
⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，用三氯醋酸检测，收集流出液；
⑦Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；
⑧10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。
⑨用20％的乙醇充满柱子，保存在4℃。
注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。
C、柱的清洗与保存（最好每天清洗一次）：
（1）去Ni离子：
①5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；
②10×柱体积的DDW洗涤。
（2）去沉淀的蛋白质：
①5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；
②DDW洗涤，至流出液的pH值为7。
（3）保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。
D、柱的再生：
当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时，应进行柱的再生。
① 2×柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后3×柱体积的DDW洗涤；
② 1×柱体积的2％SDS洗涤；
③ 5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；
④ 5×柱体积的DDW洗涤，然后5×柱体积的100mM EDTA，pH8.0洗涤；
⑤ 3×柱体积的DDW洗涤，然后3×柱体积的20％乙醇洗涤；
⑥ 20％乙醇保存于4℃。
【备注】Ni2+亲和层析柱纯化缓冲液（1×Buffer）：
reagents | Binding Buffer | Wash Buffer | Elute Buffer | Strip Buffer | Charge Buffer | M |
Tris-HCl pH7.9 | 20 mM | 20 mM | 20 mM | 20 mM | 121.14 | |
Imidazole | 5 mM | 60 mM | 1M | 60.08 | ||
NaCl | 0.5 M | 0.5 M | 0.5 M | 0.5 M | 58.44 | |
EDTA | 100 mM | 372.24 | ||||
NiSO4 | 50 mM | 262.85 |
4. 目的蛋白的SDS-PAGE
分别取加有IPTG的空载体pET22(b+)表达的上清液、未加IPTG和加IPTG诱导的重组子全提取物、超声波破碎后的上清液和沉淀(即包涵体)、 纯化后的蛋白溶液，进行12％SDS-PAGE分析。通过蛋白质分子量标准，判断目的蛋白的相对分子质量，并对纯化后的蛋白进行纯度分析。
5、蛋白质的复性
目的蛋白在大肠杆菌中以包含体形式存在，要获得有活性的产物，必须对纯化的目的蛋白进行复性。将收集的洗脱流出液装入透析袋，对含适量甘油的0.01 mol/L PBS pH8.0透析48 h，每4～8 h更换一次PBS溶液。然后，将上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，对蛋白溶液进行浓缩。
