从包涵体中纯化表达蛋白
实验材料 表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
试剂、试剂盒 细胞裂解缓冲液 I细胞裂解缓冲液Ⅱ脱氧胆酸浓盐酸包涵体溶解缓冲液 I包涵体溶解缓冲液ⅡKOHPMSFSDS 凝胶加样缓冲液含尿素的 Tris-ClDNaseI溶菌酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶
仪器、耗材 Sorvall GSA 转头或相当的转头pH 试纸磨光玻璃棒
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
细胞裂解缓冲液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
细胞裂解缓冲液Ⅱ, 冰冷
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
0.5% TritonX-100
脱氧胆酸
使用蛋白级的胆酸/去污剂。
HCl(12mol/L)(浓盐酸）
包涵体溶解缓冲液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
8mol/L 尿素
0.1mol/LPMSF
缓冲液现用现配。
包涵体溶解缓冲液Ⅱ
50 mmol/LKH2PO4(pH10.7)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
50 mmol/LNaCl
KOH(10mol/L)
PMSF(100 mmol/L)
1x 和 2XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，lmol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)
仅限于方法 2 使用，请见步骤 7。配制内含尿素浓度递增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的 0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。
酶和缓冲液
DNaseI(1 mg/ml)
溶菌酶（10 mg/ml)
用 Tris-Cl(PH8.0) 现用现配。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8。
离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
特别配备
pH 试纸
备用，请见步骤 10。
磨光玻璃棒
载体和细菌菌株
表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
培养 1L 以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
方法
制备细胞抽提物
1.1L 表达细胞培养物于预先称重的离心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min。
注意：步骤 2~4—定要在 4°C 进行。
2. 吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。
3. 每克（湿重）菌体加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物（见方案 1)。
4. 每克（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。
5. 悬液 37°C 放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。
6. 裂解液室温放置，直至不再黏稠（约 30 min)。
纯化和洗涤包涵体
7. 用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。
方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵体
下述流程是对 Marston 等（1984) 所用方法的改进。
a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。
b. 倾倒去除上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4°C 细胞裂解缓冲液Ⅱ。
c. 悬液室温放置 5 min。
d. 高速离心 15 min。
e. 倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于 100ul 水。
f. 各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。
g. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。
方法 2: 用尿素提取包涵体
下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自 Schoner 等 (1985)。
a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。
注意：步骤 b、d 和 f 必须在 4°C 进行。
b. 倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于 1 ml 水中。每支 100ul 装 4 支离心管，其余 4°C 保存。
c.4°C 高速离心 15 min。
d. 毎份沉淀重悬于 100ul 含不同浓度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。
e.4°C 高速离心 15 min。
f. 倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于 100ul 水中。
g，各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。
h. 用步骤 g 确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤 b)。
i. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。
溶解包涵体
8. 取适量步骤 7 的重悬细胞沉淀，4°C 高速离心 15 min, 沉淀重悬于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(现用现加）的包涵体溶解缓冲液 I。
9. 室温放置 lh。
10. 把溶液加入到 9 倍体积的包涵体溶解缓冲液 II 中，室温放置 30 min。检査 pH 是否维持在 10.7, 必要时用 10mol/LKOH 调节。
11. 用 12mol/L 盐酸将溶液 pH 调至 8.0, 室温放置至少 30 min。
12. 室温高速离心 15 min。
13. 倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液。
14. 取 10ul 上清与 10ul 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度，继续附加方案。
