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从包涵体中纯化表达蛋白

2019.9.10

实验方法原理	蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。这些由表达蛋白聚集成的包涵体很容易与可溶性蛋白和膜结合蛋白分离。高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。包涵体经离心沉淀后，可用Triton X-100和EDTA或用尿素洗涤。多数情况下，调整洗涤条件可使包涵体中外源蛋白的纯度达到90%以上。
实验材料	表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
试剂、试剂盒	细胞裂解缓冲液 I 细胞裂解缓冲液Ⅱ 脱氧胆酸浓盐酸包涵体溶解缓冲液 I 包涵体溶解缓冲液Ⅱ KOH PMSF SDS 凝胶加样缓冲液含尿素的 Tris-Cl DNaseI 溶菌酶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
仪器、耗材	Sorvall GSA 转头或相当的转头 pH 试纸磨光玻璃棒
实验步骤	材料缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录 1。贮存液稀释至适当浓度。细胞裂解缓冲液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 细胞裂解缓冲液Ⅱ, 冰冷 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 0.5% TritonX-100 脱氧胆酸使用蛋白级的胆酸/去污剂。 HCl(12mol/L)(浓盐酸）包涵体溶解缓冲液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 8mol/L 尿素 0.1mol/LPMSF 缓冲液现用现配。包涵体溶解缓冲液Ⅱ 50 mmol/LKH₂PO₄(pH10.7) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 50 mmol/LNaCl KOH(10mol/L) PMSF(100 mmol/L) 1x 和 2XSDS 凝胶加样缓冲液不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存，lmol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5) 仅限于方法 2 使用，请见步骤 7。配制内含尿素浓度递增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的 0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。酶和缓冲液 DNaseI(1 mg/ml) 溶菌酶（10 mg/ml) 用 Tris-Cl(PH8.0) 现用现配。凝胶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%) 用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8。离心机和转头 Sorvall GSA 转头或相当的转头特别配备 pH 试纸备用，请见步骤 10。磨光玻璃棒载体和细菌菌株表达靶蛋白的大肠杆菌细胞培养 1L 以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞方法制备细胞抽提物 1.1L 表达细胞培养物于预先称重的离心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min。注意：步骤 2~4—定要在 4°C 进行。 2. 吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。 3. 每克（湿重）菌体加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物（见方案 1)。 4. 每克（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。 5. 悬液 37°C 放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。 6. 裂解液室温放置，直至不再黏稠（约 30 min)。纯化和洗涤包涵体 7. 用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵体下述流程是对 Marston 等（1984) 所用方法的改进。 a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。 b. 倾倒去除上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4°C 细胞裂解缓冲液Ⅱ。 c. 悬液室温放置 5 min。 d. 高速离心 15 min。 e. 倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于 100ul 水。 f. 各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。 g. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。方法 2: 用尿素提取包涵体下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自 Schoner 等 (1985)。 a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。注意：步骤 b、d 和 f 必须在 4°C 进行。 b. 倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于 1 ml 水中。每支 100ul 装 4 支离心管，其余 4°C 保存。 c.4°C 高速离心 15 min。 d. 毎份沉淀重悬于 100ul 含不同浓度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。 e.4°C 高速离心 15 min。 f. 倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于 100ul 水中。 g，各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。 h. 用步骤 g 确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤 b)。 i. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。溶解包涵体 8. 取适量步骤 7 的重悬细胞沉淀，4°C 高速离心 15 min, 沉淀重悬于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(现用现加）的包涵体溶解缓冲液 I。 9. 室温放置 lh。 10. 把溶液加入到 9 倍体积的包涵体溶解缓冲液 II 中，室温放置 30 min。检査 pH 是否维持在 10.7, 必要时用 10mol/LKOH 调节。 11. 用 12mol/L 盐酸将溶液 pH 调至 8.0, 室温放置至少 30 min。 12. 室温高速离心 15 min。 13. 倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液。 14. 取 10ul 上清与 10ul 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度，继续附加方案。展开
注意事项	包涵体复性注意事项 1. 最适 pH 值范围为 8.0-9.0 之间； 2. 温度适宜选择 4℃； 3. 复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4. 复性时间一般为 24-36 小时； 5. 低分子化合物如 L-Arg 有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris 对蛋白质复性有促进作用；EDTA 可以防止蛋白降解； 6. 首先要获得较高纯度的包涵体； 7. 包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8. 透析前后均要离心； 9. 包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量 Triton-X100； 10. 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11. 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ； 12. 复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13. TritionX100、SDS 这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用 Triton 洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下 3-4 条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14. 复性时的蛋白浓度一般为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。展开
其他	一、附加方案，请参考 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/B1442910480png_small.jpg 二、蛋白质重折叠方法，请参考 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/A1442910608png_small.jpg 三、包涵体复性常见问题分析 1. 包涵体复性原则低浓度，平缓梯度，低温。4 n( O5 ~0 q8 D; 2. 怎样洗涤包涵体？通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用 6M 盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 3. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素 8-10M，盐酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为 70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 4. 8M 尿素溶解的包涵体溶液应如何保存? 在 4 度放置半个月，都没什么问题。在室温放置超过 48 小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理 BI 溶液比较好。 5. 复性时的蛋白浓度是？一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。 6. 蛋白复性后浓度低蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。可以将复性好的蛋白浓缩一下跑胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。 7. 复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和 PH 值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔 1 个 PH 或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到 2M，盐酸胍可加到 1-1.5M；另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。 8. 复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 (1)凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 (2)光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 (3)色谱方法：如 IEX、RP-HPLC、CE 等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同， (4)生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 (5)黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。 (6)免疫学方法：如 ELISA、WESTERN 等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔。展开