扒一扒进口基因测序仪中的一朵“奇葩”
本文由原创作者 矮小森 授权 分析测试百科网发表，从中我们可以闻到NGS战场上的硝烟，感受到科学奇才们的大胆创意和持续的斗志。
说起基因测序仪，很多人都会第一时间想起进口的品牌和产品。这没办法，因为目前能够有自主知识产权和生产能力的国内制造厂家，仅有华大基因、华因康和真迈生物等不多的几家；后两家离大规模销售也还有一段距离。从市场占有率来看，目前只有华大是能够勉强正面和进口品牌抗衡，这就是现实的情况。
进口品牌有这么多，从 illumina （原 SolexaTM，NGS 高通量测序技术）和 ThermoFisher（原 ion torrentTM，NGS 高通量测序技术，这里不是指 ABI 的毛细管电泳一代测序技术），到 Nanopore （第三代纳米孔技术）和 Pacific biosciences（简称 Pacbio，三代单分子测序技术）等等，他们都牢牢占据了很多用户心中的高大上的进口产品的地位。笔者认为其中有一朵“奇葩”，今天我们来带大家好好扒一扒。
说起这朵“奇葩”（词典的原意是“奇特而美丽的花朵”），笔者在这里没有一丝丝的贬义。因为它是在高通量基因测序仪新时代三国争霸中的三强之一1；它最早源于 2010 年在美国商品化的 ion torrentTM 的产品，采用了电信号检测原理，理论上灵敏度要优于基于荧光光学检测的测序技术；而且其测序方法和另外两家主流的 NGS 厂家也都不太一样，理论上读长也有更长的可能（因无荧光干扰）。
说到这里，大家应该都能猜到，说的就是基于“半导体测序法”的高通量测序仪，目前是在ThermoFisher（赛默飞世尔）旗下。因为这是ThermoFisher在 2014 年收购 Life technology公司所获得的产品，所以在下文中，笔者把这一类商品化测序仪，均统称为“life 测序仪”。在售的型号包括 PGM (personal genome machine，2010 年发布)，ion Proton(2012 年发布)，ion S5 系列 (2015 年发布)以及最新的 Genexus 系统(2019 年发布)等。
那咱就从 life 测序仪的缘起说起。
2005 年，罗氏 454 测序仪，一款基于“焦磷酸测序法”的高通量测序仪，开创了二代高通量测序仪的先河。但是由于各种原因造成这一技术在市场上慢慢边缘化，没有太多竞争力。
2013 年10 月，罗氏宣布逐步淘汰该项业务2。而这一技术的创始人，乔纳森·罗森博格(Jonathan Rothberg)，其实是在 2007 年就把技术卖给了罗氏，华丽转身、另立山头，也是在 2007 年用自己的积蓄，开创了 ion torrent 的新天地（罗氏心里会不会...）。在 3 年后的 2010 年 2 月，罗大神就帮助 ion torrent 推出了世界上第一台基于半导体测序法的测序仪，型号为 personal genome machine (PGM)。PGM 当时是世界上体积最小、检测成本最低的上市产品。可能，这就是革自己的命吧......
网络图片: 罗森博格和 PGM
下面请看看半导体测序法的原理3：
“利用 Ion Torrent™技术在半导体芯片上直接将化学编码的信息 (A，C，G，T) 转换为数字信息 (0，1)。此方法将简单的化学试剂与ZL半导体技术相结合——就像沃森遇到摩尔。该测序技术较其它技术更简单、快速、经济高效且扩展性更佳。半导体已经改变了它所触及的每一个行业。微处理器实现了台式计算，半导体技术推动了测序大众化，使任何实验室或临床都能够使用。
在自然界中，当聚合酶将一个核苷酸加入 DNA 链时，一个氢离子会作为副产物释放。
如果 DNA 链上有两个相同的碱基，则电压会加倍，芯片将记录两个相同的碱基。由于该过程是直接检测（没有扫描、没有相机、没有光线），因此每个核苷酸的掺入会在几秒钟内被记录下来。
以下是该技术检测碱基的方法：如果将一个核苷酸（例如 C）添加至 DNA 模板中然后整合入 DNA 链，则将会释放一个氢离子。来自该离子的电荷将改变溶液的 pH 值，这可通过我们专有的离子传感器检测到。
我们的测序仪（基本上是世界上最小的固态 pH 计）则会检测到该碱基，直接从化学信息转化为数字信息。
然后，Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) 测序仪令核苷酸逐个依次流过芯片。如果流过芯片的下一个核苷酸不匹配，则不会检测到电压变化，也就不会检测到碱基。”
来个“说人话”的版本：
半导体测序法实际上检测的就是电信号，即通过酶催化生化反应添加碱基后释放的质子引起了电信号的变化。因为在添加不同种类的碱基或不数量的碱基时，释放的质子所产生的电信号不同，所以可以通过识别电信号来识别碱基（base calling）。
根据维基百科里面 “Ion semiconductor sequencing” 词条的解释，半导体测序法的优点包括：读取碱基速度快(ion torrent 号称一小时读取 100-200 个碱基)、成本较低、无需光学测量系统等。而局限之处包括：
长重复碱基序列容易读错，比如对于 AAAAAAA 和 AAAAAAAA，那就不好区分；
读长不够长，实际上半导体测序法可做到 400 碱基/read，对比其他两家 NGS 厂家，还算是可以的，只是比 Sanger 一代测序技术和三代测序技术差一些而已；
测试通量不够高，目前其测试通量确实是低于另外两家 NGS 厂家的测序仪平台。
另外，在笔者的传统分析化学的认知世界里，同样物质的量因电化学反应产生的电信号更容易被物理元器件所感知，相对于一般的光学信号来说(可以想想你实验室里的 pH 电极和分光光度计)。所以笔者大胆猜测，理论上“life 测序仪”，它的灵敏度要好于基于荧光标记技术的 illumina 和华大的高通量测序仪。但事实是不是就是这样呢？
啪啪啪的打脸声不绝于耳......笔者做了一番搜索，好像基于目前的文章和网络信息看来，并没有什么直接的证据可以证明，“life 测序仪”和其他 NGS 测序仪相比，在灵敏度这方面没有优势。而事实上，在某些比较关键的数据质量指标比较中，例如 Q30(可以简单粗暴地理解为错误率在 0.1%的碱基占比)的比较，“life 测序仪”因长读长的“天生”表现，确实要比另外两家 NGS 厂家的数据要差。
在下面2014年发表在期刊 Applied Environtal Microbiology 的 同 行 评 议 文 章“Performance Comparison of Illumina and Ion Torrent Next-Generation Sequencing Platforms for 16S rRNA-Based Bacterial Community Profiling”，作者比较了 illumina 的 MiSeq 和 ion torrent 的 PGM 两个测序系统（当年两家的主动机型），发现：
“Consistent with previous reports (7,–9), we found that the error rate of Ion Torrent sequencing (averages of 1.5 and 1.4 errors per 100 bases for read sequences from the forward and reverse directions, respectively) was higher than that for equivalent Illumina libraries (average of 0.9 errors per 100 bases).”。翻译过来就是“（在当时的实验条件下，）ion torrent 的测序数据错误率比 illumina 测序平台的错误率要高”。
这也就难怪，虽然两者出现年代很接近，但同为进口测序仪品牌的 life 测序仪会目前远远落后 illumina 几个身位了。
为何会出现这种市场结果，笔者尝试从技术发展的角度分(nao)析(bu)一下可能的原因：
1 虽然两者初始推出时期很接近，但 illumina 的 solexa 比 life 的 ion torrent 还是要早一些（2006 vs 2007）。更早的系统发布积累更多的用户，加上很多早期的测序仪用户是生物学家也比较熟悉荧光的系统，所以这半个身位的差距，在不断发展过程中被逐渐放大。
2 从技术角度来讲，长读长的劣势、数据质量、通量不够高等问题，确实也让 life 测序仪在目前 NGS 测序仪三国争霸中慢慢往第三位靠近。前面提过长读长和数据质量的问题，下面看看通量方面的数据。请看下面两个图，分别是用于 PGM，ion Proton 测序仪和 ion S5 系列测序仪的芯片参数。由下图可知：
A. 对 PGM 测序仪，下机数据从 30Mb~2Gb；对于 ion Proton，下机数据为最大 10Gb；对于S5 来说，单次下机最大 25Gb。life 测序仪的整体是在向好的方向进步，但是有点“跟不上形势”。有兴趣的同志可以自行去了解一下 illumina 和华大目前台式 NGS 测序仪的下机数据是什么一个情况。
B. 半导体测序的测序仪在单位时间产出也没有很多优势。毕竟半导体测序法主打的是快，那么我们算一下单位时间的数据产出吧。拿数据通量最大的 S5 来计算，可知每小时最多在2.5~3.0Gb/hour 的水平（假设就用 ion S5 prime 系统来做，如果是 ion proton，那就是2.5Gb/hour）。这个，看起来也不算很高。我们拿华大的两个台式 NGS 的数据来比一下，MGISEQ-200 和 MGISEQ-2000 分别可以达到 最高 3.0Gb/hour 和 6.0Gb/hour 的水平。如果我们把测序仪看作是“生命科学计算机”的话，那这个测序单位时间产出，就有点像“生命科学计算机的内存”参数了。所以...
C. 芯片上的最大 reads 数多在几~几十 millions 的范围，这跟其余两家 NGS 厂家来比，单芯片密度确实是要低一些，这也解释了上面的“为什么半导体测序法单位时间产出优势不足”。这可能是因为芯片制作工艺已经到了极限，无法进一步拓展（此点笔者无法确认，请知情人士交流一下，谢谢）。
3 从公司发展角度来讲，NGS 新时代三国争霸中，illumina 和华大都是传统的基因公司，整个公司的资源和研发能力、人力物力都是在往测序业务这一块 all-in 的。而收购了 ion torrent的 life technology，在 2015 年找了个好娘家 ThermoFisher，实力看起来更雄厚了呢。但后面life 测序仪的发展，也没有给大家带来很多亮眼的操作。这也可能是因为这是ThermoFisher的一贯的作风，请看看ThermoFisher近十几二十年的基本操作：善于资本运作和收购的Thermo，先是“蛇吞象”地并购了Fisher，成为了 ThermoFisher；而后它吸收了众多有名的牌子，如 Finnigan 的质谱、尼高力的红外、戴安的离子色谱、FEI & 飞纳的电镜等(仅仅列举部分有名的科学仪器，其他各种品牌数不胜数)；到了最后用户只知道有个赛默飞，而把原来的品牌给忘了。
为了更进一步开拓中国市场，life 测序仪的商业团队也在中国市场上寻找了一些小伙伴，如达安基因（型号 DA8600，国械注准 20143401961）、博奥生物（型号 BioelectronSeq4000，国械注准 20153400309）、重庆泛生子（型号 GENETRON S5：国械注准 20193220820）等，通过 ODM 的手段，进一步拓展 ion Proton 和 ion S5 在医疗领域中的市场。但根据 NMPA公开查询的结果来看，达安和博奥的产品医疗器械注册证已过了有效期而且并没看到更新。
Ion PGM™ and Ion Proton™ System Chips
赛默飞 Ion Proton
达安基因 8600
博奥生物的 BioelectronSeq 4000 测序仪
赛默飞 Ion S5 & 泛生子 Getron S5
赛默飞 Ion Torrent Genexus System 测序仪系统
而在 2019 年 11 月，赛默飞推了最新的 NGS 测序仪型号“Ion Torrent Genexus System”。主打的概念大家可以感受一下：“一天内自动完成从样本到报告的工作流程”、“第一个一站式的高通量测序（NGS）解决方案”、“可自动执行从样本到报告的工作流程，仅需两步操作即可在一天之内提供结果”。
从以下来自官网的介绍简图看，这 Genexus 系统是一整套绑定了“核酸提取、纯化系统”、文库制备、测序及分析软件”的整体系统。因此确实是有希望提供 NGS 测序全流程的覆盖。但目前能够全流自动化的程覆盖哪些应用，还不太清楚。笔者认为，这将会是临床测序仪的一个大趋势，即把 NGS 测序仪做成一个黑箱(black box)，用户只需要放血浆样品进去，经过一定的时间，机器自动操作自动分析，即可获得临床报告的输出结果。遗憾的是，目前该产品还是“仅供研究使用，不可应用于诊断程序”的状态。
无独有偶的是，华大好像也已经捣鼓出来这种一体式自动化的测序系统，并已经在某医院进行联合测试4，并声称“（MGIFLP）作为全球首台一站式高通量测序系统，MGIFLP 突破了以往建库自动化和测序自动化分离的状态，整合了全血处理和分离模块，通过轨道自动连接，可支持微生物快速检测，单菌快速鉴定以及耐药基因和毒力基因鉴定，让高通量测序以前所未有的高效和便捷在临床端开展。”可见，NGS 测序仪的厂家都是想到一块去了。
回到 life 测序仪上，究竟是什么原因，life 测序仪没有和达安基因、博奥等厂家继续前面在临床领域的合作，笔者不得而知。但是，从 life 测序仪在 2019 年又找到另一个合作伙伴以及推出一体化的 Genexus 系统这些事实来推断，life 测序仪不会轻易放过中国临床测序应用市场这一块大蛋糕的。
随着国家层面的大健康政策制定和完善，卫健委也对基因测序这一前沿技术持越来越开放的态度。近年来不断增加的测序相关的临床认证试剂及仪器，就是很好的明证。笔者相信，未来 2-5 年临床测序的测试需求会呈现快速爆发增长的趋势。因此，摆在 life 测序仪以及其他 NGS 厂家面前将会是一个越来越大的蛋糕。但究竟在这一阶段中，每个厂家能怎么发展，能分得多大的蛋糕，还是得看自己的内功。
究竟是 ion torrent 这一国外“奇葩”测序技术老树发新芽，还是走上 454 测序仪的老路(来自老罗的诅咒 -_-|||)？让我们拭目以待。
参考资料：
1 《基因密码 2》，“超级测序仪争霸战”章节，华大基因股份 CEO 尹烨注
2 《罗氏将关闭454测序业务》，生物通
3 ThermoFisher官网中关于“ion torrent 高通量测序技术”的页面，链接：
4 《一个按键，一站包办？ | 全球首台一站式测序工作站 MGIFLP 在珠江医院开展联合测试》，华大智造官网
