血细胞分离培养方法和步骤-2
收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9%
Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll来调整。
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：
从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常用到的。方法如下。
无菌取上述淋巴器官，若为扁桃体，应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后，在含高浓度抗生素的洗液中4℃浸泡2-4h，以防污染。
将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤碎块，或在金属丝网上研磨，用洗液冲洗，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液。
自然下沉10min后，吸取上层细胞悬液，弃去下层沉淀的组织块，1500r/min离心，取沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗2次后，混悬于培养基中，分瓶培养。
用上述分离法所获得的拎包细胞，可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时可用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)、Tδ细胞等，供细胞移植用。
（三）人脐带血细胞分离培养：
人脐带血来源方便，采集容易，对母婴均无伤害。近年来研究表明，脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力的功能，是造血生长因子的重要来源。
脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞，其中CFU-G、BFU-E、CFU-GM近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/祖细胞，比骨髓更原始，具有很强的自我复制和再植能力。脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞，对骨髓造血具有支持作用，在体外培养扩增中具有更大的增值能力，是造血干细胞的理想来源，已被应用于Fanconi贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗，并容易获得骨髓造血功能的重建。
随着脐带血造血功能研究的不断深入，为体外培养和扩增脐带血干/祖细胞建立了切实可行的方法。
健康产妇于新生儿娩出后立即断脐，用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血，一般可采集50-80ml。
将脐带血用无钙、镁离子的PBS稀释2-3倍，缓慢沿壁轻轻加入含Ficoll-Hypque淋巴细胞分离液的离心管中，注意加样时切勿冲破分层界面，2500r/min离心25min。
收集单核-淋巴细胞层细胞，先用PBS洗2遍，再用培养基洗1次，活细胞计数，存活率应大于90%以上。
将分离获得的脐带血单个核细胞（MNC），浓度109个/L，用含5%AB型血清（或10%脐带血）的RPMI1640培养基，外加10mg/ml干细胞因子（SCF）、10ng/mlIL-6和IL-3、2U/mlEPO、10ng/ml的G-CSF和GM-CSF，置于37℃、5%CO2下进行培养。
每周半量换液一次，共培养5周。10天左右可传代培养，不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增，培养5周，可使单个核细胞数增加252倍，同时了检测造血干细胞中CD34+细胞的比例，经检测，CD34+细胞增加250倍。一般脐带血中MNC体外扩增2周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求。
若在分离获得的脐带血单个核细胞中，用含20%小牛血清的ROMI1640培养基外加二羟基维生素D3、地塞米松、维生素C等刺激物，培养1-2周后，可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形），说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长。
（四）巨噬细胞分离培养：
巨噬细胞有多种功能，是免疫应答中重要的抗原递呈细胞，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。该细胞易获得，便于培养。人巨噬细胞难以长期生长，多用作初代培养。目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠，如P388D-1、J774A-1、RAW309、Cr-1等均以恶性化，但仍保留原有形态和吞噬功能，易于传代和脱壁分离。
巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等，实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取，通常预先注入刺激物后再采集，以小鼠腹腔取材法最为实用，方法如下。
实验前3天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基1ml。
引颈杀死小鼠，手提尾将全鼠浸入70%酒精中浸泡3-5s。
置动物于解剖台上，用针头固定四肢，剪开腹部毛皮，双手用镊子撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，切勿撕破腹膜。
用70%酒精棉球擦洗腹膜后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，使液体在腹腔内充分流动。
用针头轻轻挑起腹壁，将动物微倾向一侧，是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内。
小心拔出头，将液体注入离心管中，1500r/min离心10min去上清，加10mlEagle MEM培养基洗2-3次后计数。
每只小鼠可产生（2-3）x10^7个细胞，其中90%为巨噬细胞，以2.5x109个/L接种培养。
为纯化巨噬细胞，去除其他白细胞，接种数小时后，待巨噬细胞预先充分贴壁，此时去除原培养基，并用Eagle液洗瓶壁1-2次，再加入新Eagle MEM培养基，置37℃、5%CO2温箱中培养。
