血细胞的分离方法-2
4、从3中所获得的中性粒细胞进行纯化
1）因为方法3只能获得80－85%纯度的中性粒细胞，可以把方法2与方法3联合对中性粒细胞进行纯化。
2）收集从方法3 dextran沉降所得到的富含白细胞的血浆，275g*6min，离心。
3）管底沉淀用2ml PPP重悬
4）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min。
5）分别用PPP及KRPD各洗1次
6）用这种方法所得的中性粒细胞纯度高达99%以上，并且中间不需要红细胞裂解的步骤。
krebs-Ringer phosphate（KRPD缓冲液）的配制：
130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4
配制方法：
A液：NaCl 7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；
B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O 0.3130g，充分溶解。
将A、B混合，用ddH20将体积调节至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4，定容至1000ml。
外周血中嗜碱性粒细胞分离方法（聚蔗糖－泛影葡胺法）
1）取肝素抗凝血3ml
2）加等量PH7.4HEPES-ACM缓冲液（HEPES 25ml含CaCl2 1ml,NaCl 130ml,KCL5mmol,MgCl2 1ml,用NaOH调节至PH7.4)混匀后，叠加在3ml的密度为1.085的分离液上，2000r/min离心20分钟；
3）吸取中间层的白细胞，用Hanks液洗2次，每次1000r/min离心10分钟，弃上清；
4）调整细胞浓度，涂片染色计数，嗜碱性粒细胞浓度大于90％。
外周血中嗜碱性粒细胞分离方法（Percoll密度梯度离心分离法）
1、Pcrcoll混悬液的配制：Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 调节至PH7.4
2、制备Percoll密度梯度管
| 密度 | Percoll/HBSS(ml/ml) |
| 1.070 | 24:20 |
| 1.079 | 27:15.9 |
| 1.088 | 23:10 |
3、加分层液的顺序：底层先加4ml 1.088g/mlPercoll液，第二层加4Ml1.079g/mlPercoll液，嘴上曾加3ml 1.070g/ml的Percoll液，制成3个密度梯度管，用于分离碱性粒细胞。 4、将新鲜的抗凝血（用0.1mol/lEDTA PH 7.7抗凝）按等体积加于Percoll密度梯度分层液上，室温下1200r/min离心25分钟。
5、将每一细胞层分别吸出各放于1支试管内，加无Ca,Mg离子的Hanks液在4度下洗涤3次，每次 1200r/min,离心10分钟弃去上清。
6、将分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在显微镜下检查嗜碱性粒细胞（大多数在中间层，但不同个体嗜碱性粒细胞的密度不同，因此可能会出现在其他细胞层），嗜碱性粒细胞染成紫红色。
外周淋巴血细胞分离（ficoll密度梯度离心法）
1.肝素抗凝静脉血，用Hank’s液约等体积或2倍体积稀释
2.用滴管轻轻加到 FICOLL上，注意：动作要轻，缓，血液层和FICOLL层的界面要清晰。FICOLL和稀释后的血的体积比甚至可以达到1：4
3.离心:温度为25 度，2000rpm 20分钟
4.离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带（注意不要吸到FICOLL层），置于另一试管中
5.加入尽可能多的 Hank’s液洗涤吸取的细胞，1600rpm 8分钟，洗2次
6.细胞计数，将细胞以一定的浓度种到培养板中，加入营养液培养。
7.分离的时候特别要注意温度，FICOLL和Hank’s液以及营养液使用之前要37度温一下；血液层和FICOLL层的界面清晰；FICOLL离心温度为25度，不能使用离心机上的brake功能。
外周淋巴细胞分离方法
1.5ml 抗凝血缓慢沿壁加到5ml淋巴细胞分离液上。（我用的是15ml离心管。有一次用50ml离心管，同样是5ml血对5ml分离液，就没分开，可能是淋巴细胞分离液的高度不够。如果血开始保存在4度，记得要回温到室温才开始添加）
2.室温 500g离心20分钟（好像离心时间不能过长，否则对细胞不好）
3.取中间云雾状白色杂带，置于另一50ml离心管中。
4.25ml PBS洗涤（如果混有红细胞，在之前可以用红细胞裂解液，37度裂解5分钟。）
5.1,000 rmp 离心10分钟
6.重复4和5
7.2ml 10% 胎牛血清+RPMI1640重悬。
8.计数
9.调整至10ml后培养。
如果要冻存，用冻存液（10%DMSO+20%
胎牛血清+RPMI1640）4℃,1-2h→-20℃,0.5h（这一步时间不能过长，否则冰晶过大，对细胞有害）→-80℃过夜
，然后液氮中保存。如果，有那种能一度一度降温的盒子，冻存就好办了。直接按照它的说明做就行了。
单核细胞分离方法
将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10
小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃ 下孵育2
h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1
640培养液悬浮单核细胞，Wright染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5
％CO2，37℃ 下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃ 冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。
单个血小板的分离和保存
无菌操作下穿刺肘中静脉取血，取用2% EDTA (1∶9)抗凝新鲜血,经100 ×g离心10 min, 获得富血小板血浆( PRP) ,
经含1 g/L 牛血清白蛋白(BSA ) 的Hepes Tyrodes洗脱液平衡的Sepharose
2B凝胶柱分离纯化后得血小板沉淀,然后用TEN缓冲液(0. 05mol/L Tris2HCl, 0. 15 mol/L NaCl, 6
mmol/L ED2TA, pH 7. 4)洗涤3次,最后血小板悬浮于TEN缓冲液中,调血小板密度为1 ×109 /ml,加入终浓度为1
mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF)和1%的Triton X2100,置于4 ℃冰箱过夜,次日10 000 ×g
离心15min,取上清液为血小板破碎液,分装, - 20 ℃保存备用。细胞培养前后用台盼蓝染色法测定细胞存活率 。
