微流控芯片技术应对临床检验医学考验（一）
一、微流控与微流控芯片
微流控（Microfluidics）的含义是微尺度下的流体控制，其研究对象是使用微米级通道操控纳升级以下微量液体的系统[1-3]。鉴于芯片是实现微流体控制的主要平台，因而微流控芯片（Microfluidic chip）是微流控的主要研究内容。
微流控芯片的制作主要依托于MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）加工工艺，具有在微米尺度级别实现微量流体操控的能力。微流控芯片技术的特点来自于两个方面：一是微流体的特性微尺度下流体的一系列特殊效应包括层流效应、表面张力及毛细效应、快速热传导效应和扩散效应等，这些效应有利于精确流体控制和实现快速反应；二是微加工工艺带来的结构复杂性微加工工艺具有加工小尺寸、高密度微结构的能力，便于实现各种操作单元的灵活组合与规模集成。因此，样品前处理、分离与分析、检测等实验流程得以在同一芯片上集成化和并行化，从而达到微型化、自动化、低消耗和高效率的目的[4,5]。
微流控研究起始于20世纪90年代，至今已经有二十余年的发展历史，其间经历了基础理论奠定、单元操作技术发展、小规模集成和大规模集成几个历史发展阶段。至今，微流控技术已经较为成熟，已经在多个领域得到认可并广为利用,其产业化趋势亦是愈发明显[6]。2003年《福布斯》杂志把这项技术评为“影响人类未来15件最重要发明之一”；2004年，美国Business 2.0杂志封面文章将微流控芯片列为“改变世界”的七种技术之一；2006年Nature杂志出版了一期微流控专辑，题名为“本世纪的技术”。
二、微流控体外诊断技术的优势
体外诊断（In vitro diagnosis, IVD），是指对人体的体液和组织等进行检测而获得临床诊断信息。微流控芯片是体外诊断的有利技术平台[7,8]，这表现在以下几个方面：1.应用场景拓展传统的检验设备多为大型仪器，虽然在测试通量和稳定性上具有优势，但其使用局限于专业实验室。微流控芯片系统体积小巧、操作简单，完全可以在门急诊、基层医疗单位甚至床边进行检测，这极大地拓展了体外诊断的应用空间；2.分析效率的提高集成化和并行化设计的微流控芯片系统，有能力在短时间内提供更为丰富的诊断信息，因而显著提升了分析效率；3.测试成本的下降微流控芯片使用微反应体系，能够大幅降低试样消耗从而降低测试成本[9]。概括来讲，微流控体外诊断技术的优势可以归结为多、快、好、省四个字，这种分析技术无疑是对现有体外诊断技术的巨大提升。
微流控体外诊断技术已经引起了国家层面的重视。2016年国务院“十三五”国家科技创新规划中关于体外诊断产品的章节写到“突破微流控芯片等关键技术，开发全自动核酸检测系统等一批重大产品，研发一批重大疾病早期诊断和精确治疗诊断试剂以及适合基层医疗机构的高精度诊断产品，提升我国体外诊断产业竞争力”。由此可见，微流控体外诊断技术的发展已经上升到国家战略层面。
作者所在研究团队工作于临床检验第一线，课题组的研究方向是针对临床检验中的痛点问题发展创新微流控诊断技术。经历了十余年的研究历程，课题组对于微流控体外诊断技术在临床检验医学中的应用价值逐步加深了理解。本文中就课题组对于微流控技术的理解以及我们的一些体外诊断应用尝试与大家分享，希望能够对检验医学同仁有所帮助。
三、微流控芯片技术在体外诊断领域的应用尝试
当前，传统的体外诊断技术已经极为成熟。微流控体外诊断产品若要进入体外诊断市场，势必要展示出高人一筹的能力。相比较传统的宏观检验设备，微流控产品最大的市场拓展潜力在于：1.针对传统产品无法适用的应用环境开发产品；2.发展性能指标和操作便利性具有明显优势的颠覆性新产品。一个成功的微流控体外诊断产品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和测试成本等几个方面达到平衡。以下，我们就课题组在几个关键的临床检验应用领域的研究工作加以介绍。
（一）分子诊断
分子诊断是新兴的检验医学领域。随着荧光定量PCR的推广，基因检测技术在临床医学中得到了广泛应用。尽管如此，现有核酸分析平台的一些不足之处还是限制了分子诊断技术的推广：1）场地要求严格，试剂准备、核酸提取和扩增需要分别在独立房间内进行，极大限制了该技术在医疗资源有限条件下的开展；2）采用离线式分析，操作复杂、分析周期较长，不利于应对突发性事件；3）现有的荧光定量PCR方法多是针对单一指标检测设计，对于多重基因检测无论是操作繁琐程度还是测试成本均是难以接受的。
分子诊断是微流控芯片技术最具有代表性的应用领域。对于分子诊断应用，微流控芯片最大的贡献在于该技术有潜力将核酸提取、扩增和检测集成于同一装置，因而可摆脱繁琐操作以及对专业实验室的依赖。此外，由于反应过程处于封闭的环境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片还需要具有一定的分析通量以满足临床实际需求。已经商业化的微流控分子诊断产品基本都是针对病原微生物检测应用，其价值在于：1.实现现场快速检测；2.解决难于培养鉴定病原（如结核杆菌、病毒、支原体等）鉴定问题。
作者课题组最近发展一种液滴阵列微流控芯片核酸分析系统[10]。这种便携式系统包含机械、磁力和光学检测单元，其设计理念是平衡集成、通量、成本及便携性等关键因素，发展适合于现场应用的病原筛查工具。系统所用微流控芯片上设计有多组以狭缝通道连通的串联微池，全部分析试剂均以油包水形式预存储于其中。由于表面张力效应，油相可以浸润微池和狭缝而水相不能。利用磁铁阵列驱动磁珠在串联液滴中穿行，程序化完成细胞裂解-核酸结合、磁珠洗涤、核酸洗脱、扩增/检测等一系列步骤，从而实现自动化和平行化核酸分析。该系统极为紧凑，适合于现场快速检测及医院门急诊场景下的“随到随检、快速响应”需求。课题组将这一系统用于性传播疾病病原筛查，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、生殖支原体等四种病原的筛查可在45 min内完成。
图1 液滴阵列微流控芯片核酸分析系统。A. 分析仪器实物及结构示意图; B. 分析原理示意图。
（二）免疫检测
免疫检测是临床检验极为重要的领域。目前，临床免疫检测的主流技术是化学发光和免疫比浊法，具有灵敏度高和检测线性范围宽的优势。这些检测方法一般使用大型仪器，分析通量较高。但是，由于购置成本和仪器体积因素，这类设备仅适合于大型实验室使用。基于试纸条的胶体金法是快速免疫检测的主流技术，该技术虽然使用方便，但在灵敏度和线性范围方面受限。因此，临床检验工作需要一种兼具操作便利性、检测灵敏度和定量准确性的免疫检测平台，这对于急诊以及基层医疗单位尤其重要。
图2 液滴阵列微流控芯片免疫分析系统。A. 分析仪器结构示意图;B. 分析原理示意图。
作者课题组发展了一种微流控芯片免疫化学发光分析系统[10]。与前面介绍的液滴阵列微流控芯片核酸分析系统类似，免疫化学发光分析系统采用具有平行串联微池结构的微流控芯片。免疫化学发光分析相关的一组试剂以油包水液滴形式预存储于指定微池中。由于表面张力效应，狭缝可以隔绝水相溶液。通过程序化的磁力操控，在液滴间转移磁珠，从而将化学发光免疫分析涉及的一系列操作，包括抗原-抗体结合、磁珠洗涤、酶促发光及信号检测，在芯片分析系统内自动完成。研究利用发展的微流控化学发光免疫分析方法，进行了C反应蛋白(CRP)与降钙素原(PCT)两种感染性疾病标记物的同步检测。在优化的实验条件下，整个过程可在15 min内完成。CRP与PCT检测限分别为0.31 ng·mL-1和0.09 ng·mL-1，标准曲线线性范围分别为0.8-200 ng·mL-1和0.5-60 ng·mL-1，对照测试提示微流控芯片系统与商品化仪器检测结果高度一致。
