教你轻松玩转环状RNA测序加机制研究（一）
从表达谱至海绵机制完美进阶，教你轻松玩转环状RNA测序加机制研究
文章导读：
禽白血病病毒J亚群(ALV-J)属于逆转录病毒属，慢病毒亚科的家族成员，可引起禽类多种肿瘤性疾病，如骨髓细胞瘤、肉瘤、血管瘤、肾肿瘤和成红细胞增多症，以及禽类骨髓白血病，导致受感染鸡的高死亡很率。该分散的ALV-J菌株分布广泛，既能水平传播又能垂直传播，往往造成禽类养殖领域的巨大经济损失。目前我们对ALV-J诱导的肿瘤发生机制仍不清楚，导致根除ALV-J带来的损害仍然是一项重大挑战。
近日，云序客户华南农业大学的谢青梅研究团队利用云序生物提供的环状RNA测序、RIP和RNA pull down等技术手段首次揭示了感染了逆转录病毒ALV-J的家禽鸡显著上调的circ-Vav3通过海绵吸附gga-miR-375的作用来上调靶基因YAP1的表达，从而促进肝肿瘤的发生。该研究成果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”为题发表在《RNA Biology》（IF: 5.216）。值得注意的是，该研究团队前期已经利用云序生物提供的环状RNA测序服务成功发表了一篇ALV-J病毒抗性与病毒易感的鸡肝脏组织当中环状RNA表达表达谱的文章（Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens），发现了32个差异表达的环状分子，其中12个在ALV-J抗性样本中表达量显著升高，而20个在易感样本中表达量更高，而生信预测表明这些环状RNA分子能够调控免疫分子通路的信息传递从而改变生物体的免疫力。此次又与我司深入合作，利用RIP和RNA pull down技术阐明了其通过海绵吸附的调控作用来促进肝肿瘤的形成。真正实现了从环状RNA表达谱至功能机制研究的完美进阶，为其他物种或疾病类型的研究提供了不错的参考。
前言：
该团队先前的研究揭示gga-miR-375在禽类白血病病毒J亚群(ALV-J)感染的鸡肝脏肿瘤中表达显著下调。结合当下的研究热点认为gga-miR-375可能与circRNA有关。在本研究中，环状RNA测序结果显示，在感染ALV-J的鸡肝脏肿瘤中，circ-Vav3显著上调。进一步通过RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH实验证实circ-Vav3是gga-miR-375的海绵。此外，研究者通过双荧光素酶报告基因检测证实YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且进一步验证了circ-Vav3通过海绵吸附作用释放gga-miR-375的靶基因YAP1，进而通过circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴影响上皮间质转化（EMT）过程以促进肿瘤的发生，并在临床样本中得到了验证。
研究内容：
1.circRNA表达谱及其结合位点预测
研究人员以ALV-J感染的鸡肝为测序样本，通过环状RNA测序（由云序生物提供）检测到有2822个circRNAs呈现差异性表达，其中2808个circRNAs显著性上调。并通过聚类图、火山图和散点图对25种表达上调的circRNAs进行生信分析，发现circ-Vav3上调最显著。此外，该团队先前的研究揭示了同样的样本中gga-miR-375下调最明显。接下来利用TargetScan和miRanda软件对25种circRNAs可能结合的miRNAs进行生信预测，结果显示其中circ-Vav3与gga-miR-375结合的评分最高。
2.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375
circ-Vav3的命名主要是基于该环状RNA来源于Vav3基因的8-11号外显子；预测结果显示circ-Vav3与gga-miR-375之间存在完美的靶向位点。利用海绵机制指示蛋白进行AGO2 RIP实验（由云序生物提供），对捕获的AGO2蛋白进行qPCR检测发现circ-Vav3与gga-miR-375显著富集；同时利用circ-Vav3探针进行RNA pull down实验（由云序生物提供）检测出了gga-miR-375的结合情况。RNA-FISH实验证实了circ-Vav3主要存在细胞质，而gga-miR-375即存在于细胞质又存在于细胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通过相互结合发挥调控作用。
