教你轻松玩转环状RNA测序加机制研究（二）
3.gga-miR-373 通过与YAP1的3’UTR区结合负调控YAP1的表达，并且过表达gga-miR-375可减弱EMT
生信预测揭示YAP1是gga-miR-375的潜在靶基因，进一步的双荧光素酶报告基因证实了gga-miR-375可通过结合YAP1的3’UTR区抑制YAP1的表达；在体外细胞系DF-1中过表达gga-miR-375可明显下调YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通过直接结合YAP1的3’UTR区，抑制YAP1基因的表达。EMT现象是肿瘤发生转移的前兆，该过程伴随着关键基因的上调（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下调（E-cadherin）。通过过表达gga-miR-375发现可以显著上调EMT正相关的基因的mRNA和蛋白水平，下调负相关基因的mRNA和蛋白水平，并且证明了EMT相关基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通过抑制YAP1基因的表达间接抑制EMT的进程。
4.YAP1过表达促进EMT，使细胞迁移能力增强
研究者进一步通过Transwell实验证明了过表达YAP1可显著增强细胞的迁移能力，同时qPCR和WB也证实在YAP1过表达的DF-1细胞系中，EMT相关的关键基因表达情况发生了明显的改变，说明YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。
5.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375上调靶基因YAP1从而促进EMT
经过前期工作的积累，研究人员认为circ-Vav3在胞浆中海绵吸附gga-miR-375，从而上调YAP1和EMT相关基因的表达。共表达实验显示，相对于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空载组），而过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（实验组）的EMT正相关基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明显上调，而负相关基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明显下调；更加证实了circ-Vav3通过海绵作用吸附gga-miR-375，上调其靶基因YAP1的表达，进而诱导EMT的发生。
6.ALV-J感染细胞系和临床样本的验证
利用ALV-J病毒株感染DF-1细胞系后，利用WB和qPCR技术手段进行检测发现，细胞中circ-Vav3表达显著上调，gga-miR-375表达显著下调；同时，YAP1和EMT正相关基因的蛋白和mRNA水平也显著的上调，相反的，EMT负相关基因的蛋白和mRNA水平则显著下调。从养鸡场获取的感染ALV-J的鸡的肝样本，进行相同的检测，得到了相同的结果，进一步夯实了整个实验的结论。
总结：
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