实时定量PCR技术综述（原理、荧光标记、TaqMan Probes和...2
下表列出了部分文献报道的TaqMan Probes技术所使用的酶和其它相关参数。
Target | P1 | P2 | Probe | Enzyme | 退火温度 | 延伸温度 |
| HCV | 19 | 25 | 27 | AmpliTaq DNA polymerase | 60℃ | 60℃ |
| HIV | 19 | 22 | 32 | AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) | 60℃ | 60℃ |
| Albumin | 22 | 22 | 26 | AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) | 65℃ | 65℃ |
| 16S rRNA | 27 | 26 | 28 | Taq DNA polymerase | 62℃ | 62℃ |
| gB gene | 18 | 18 | 27 | AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) | 58℃ | 58℃ |
| omlA | 22 | 22 | 21 | AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) | 62℃ | 62℃ |
| lytA | 21 | 21 | 25 | Taq DNA polymerase | 60℃ | 60℃ |
四.Hybridization Probes技术要点
Hybridization探针技术要求所用的热稳定 DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性,以保证探针有恒定的浓度并能反复与模板杂交。
Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶
5’→3’外切酶活性对基于Hybridization探针技术的定量PCR的影响，认为：（１）Taq酶5’→3’外切酶活性降解了部分探针；（２）Taq酶的stoffel片段（去除N端289个
氨基酸）不具有5’→3’外切酶活性，其在高浓度Mg2+存在下，能获得较好的PCR动力学曲线（如下图）；（３）stoffel片段因高Mg2+浓度造成的非特异性扩增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。
五.TaqMan 探针与Hybridization探针技术的比较
1. Hybridization探针技术的特异性高于TaqMan探针，因其信号的产生依赖于两个独立探针的特异性。但其在探针设计上需要更多的可选序列；
2.
TaqMan探针技术的开放性优于Hybridization探针技术，原因有二：（１）TaqMan探针技术的荧光标记系统是开放的，易从第三方获得，而Hybridization探针的荧光染料为罗氏专有，易受其控制；（２）TaqMan探针和Hybridization探针分别在ABI
Prism7700和罗氏LightCycler上建立，因荧光标记和仪器检测波长的不同，限制了其在两种仪器上的通用性，目前已有文献报道将
TaqMan探针用在LightCycler上，但未见报道Hybridization探针用在ABI Prism7700上，可能是ABI
Prism7700价格较贵，不适合临床应用，而ABI GeneAmp
5700SDS只有一个检测波长（530nm）；也可能Hybridization探针依赖于LightCycler的快速扩增。
3. Hybridization 探针分别标记两个探针，和TaqMan探针的同一探针三种修饰相比，修饰技术要求低，对修饰的质量控制更有利。
