淋球菌感染的实验室诊断操作手册
A1 标本的采集
女性采取标本的主要部位是宫颈管，次要部位是尿道、直肠和口咽部。男性应从尿道取材，对同性恋的男性，增加直肠和口咽部取材。
子宫颈内膜：采标本时应避免使用抗菌剂、麻醉剂和润滑剂。窥器可用温水湿润。将灭菌棉拭子、藻酸钙拭子或涤纶拭子插入宫颈管1～2cm，转动并停留拭子10～30s以吸取分泌物。
尿道：由男性病人前尿道取材时，将细棉拭子、藻酸钙拭子或接种环伸入尿道2～3cm，连续转动5s，取出分泌物应略带粘膜。在女病人应朝向耻骨联合按摩尿道后，如男病人一样的方法取材。
直肠：将棉拭子插入肛管3cm，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝中取得分泌物。
口咽：用棉拭子在扁桃体隐窝和咽后壁取材。
A2 分泌物的涂片检查
为获得一薄而均匀的涂片，应将拭子在干净的玻片上滚动，然后在空气中干燥，加热固定，革兰染色、镜检。
A2.1 革兰染色
A2.1.1 将经过固定的涂膜铺满结晶紫溶液，染1min.迅速在流水中洗净。
A2.1.2 用碘液铺满涂片，染1min.用流水轻轻洗净。
A2.1.3 用丙酮－乙醇液脱色，直到涂膜无蓝色脱下为止。通常要10～20s，取决于涂膜的厚薄。避免脱色过分，否则革兰阳性菌误认为阴性菌。
A2.1.4 很快在流水中淋洗停止脱色，将过量的水用吸水纸吸干。
A2.1.5 用沙黄或复红液复染1min.
A2.1.6 用流水淋洗，用吸水纸轻轻吸干。
A2.2 结果
使用1000×油镜检查。在患者染色的标本中可见到大量红色多形核白细胞。有些细胞中吞有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈肾形或卵圆形，常成对排列，两菌接触面平坦或稍凹。菌体长约0.7μm，宽约0.5μm。但两菌大小可有差异。不少细胞内常可见1到数对，甚至20～50对淋球菌。
A2.3 注意事项
涂片时不要用力涂擦，以防止细胞破裂和变形。涂片厚薄要合适。涂片过薄，涂片中几乎没有细胞，会造成假阴性；涂片过厚，脱色不易干净，会使各种成分难以分辨。女性生殖道中有些菌如不动杆菌等很象淋球菌，常可造成涂片的假阳性结果。咽和直肠标本的直接涂片结果也常由于正常菌丛或各种杂菌的掩盖而不可靠。
A3 淋球菌的分离培养
标本取后应立即接种于培养基中。国外常用的培养基有Thayer－Martin培养基及改良的Stuart运送培养基。国内也已研制成国产培养基，如加多粘菌素E（25μg/mL）的琼脂或巧克力琼脂。
初代分离时应用5％二氧化碳环境（烛缸），培养温度36℃为宜，相对湿度80％以上。培养24～48h观看结果。
A3.1 Thayer－Martin（TM）培养基配制法
A3.1.1 成分
A3.1.1.1 GC基础培养基
将蛋白胨1.5g、玉米粉0.1g、磷酸氢二钾（K2HPO4）0.4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.1g、氯化钠（NaC1）0.5g和琼脂1.2g混合而成。
|
A3.1.1.2 VCN抑菌制
1mL溶液中含万古霉素300μg、多粘菌素E750μg和制霉菌素1250单位。为抑制变形菌可加三甲氧苄氨嘧啶500μg.配成后应立即用完或贮于-20℃以下于2周内用完。
A3.1.1.3 Iso－Vitalex增菌剂
每升蒸馏水中加入维生素B120.01g、L－谷酰胺10.0g、P－氨基苯甲酸0.012g、腺嘌呤1.0g、鸟嘌呤0.03g、二磷酸吡啶核苷酸0.25g、硫胺焦磷酸0.1g、硝酸铁0.02g、硫胺0.003g、L－半胱氨酸25.9g、L－胱氨酸1.1g和葡萄糖100g。
A3.1.1.4 2％血红蛋白溶液
A3.1.2 配制法
A3.1.2.1 制备双倍浓度的基础培养基：将GC基础培养基7.2g溶于100mL蒸馏水中（用500mL烧瓶），充分混匀，边加热边搅动直至煮沸，使充分溶解，经高压灭菌后凉到50℃待用。
A3.1.2.2 将2g血红蛋白粉放入研钵，加2～3mL蒸馏水研成糊状，逐步加入蒸馏水直到100mL，高压121℃20min灭菌。
A3.1.2.3 配制增菌剂：每安瓿增菌剂加入稀释液2mL，使溶解。
A3.1.2.4 配制抑菌剂：每安瓿抑菌剂加入蒸馏水2mL，摇动，使充分溶解。
A3.1.2.5 以无菌手续将100mLGC基础培养基、100mL2％血红蛋白液、2mL增菌剂和2mL抑菌剂混合后倒入平皿。4℃冰箱保存、待用。
A3.2 改良Stuart运送培养基配制法
琼脂4g、蒸馏水1000mL，加热到琼脂溶化并趁热加入氯化钠3g、氯化钾3g、无水磷酸二氢钠0.15g、硫代乙醇钠1g、新配制的1％氯化钙溶液10mL和1％氯化镁10mL，pH7.3。
上述物质趁热搅动直到溶解。加入10g中性炭末。分装于13mm×10mm小管，每管5～6mL.在121℃灭菌20min，在琼脂未凝固前摇动小管，然后立即浸入冷水中使琼脂迅速凝固，要求使炭粒均匀分布在培养基中而不是沉于管底。
A3.3 结果
淋球菌经24～48h培养之后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色的菌落。边缘呈花瓣状。直径为0.5～1.0mm.用接种环触之有粘性。如继续培养，菌落体积增大，表面粗糙，边缘皱缩。淋球菌培养对症状很轻或无症状的女性和男性病人敏感性都高，因此，培养是目前世界卫生组织推荐的筛查和诊断淋病病人的主要方法。
A3.4 注意事项
某些如表皮葡萄球菌能抑制淋球菌的生长，因此，分离时应采用加抗生素的选择性培养基。但某些抗生素如万古霉素能抑制某些淋球菌（这种万古霉素敏感株在有些地区可达15％），因此，培养基中是否加入万古霉素及其加入量的多少应予注意。淋球菌对于干燥和寒冷的抵抗力很弱。为提高培养的成功率，标本离体时间越短越好。取材处离实验室较远时，应将标本先接种于运送培养基中。对症状不典型的男病人，最好是在晨起首次排尿前或排尿2～3h后采取标本。定期比较直接涂片和培养的阳性率有助于发现淋球菌培养分离中的问题。在涂片阳性而培养阴性的百分率大于平均数时，应对培养标本的采集方法、培养基的质量和培养条件等进行全面检查。
A4 氧化酶试验
淋球菌具有氧化酶，它产生的氧离子能将氧化酶试剂（盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺）氧化成醌类化合物，出现颜色反应。 |
A4.1 方法
将氧化酶试剂配制成0.5～1％水溶液。将溶液滴加于可疑菌落上，观察颜色变化。也可先将试剂滴在一小张滤纸上，然后挑取可疑菌落与之接触；或先将菌落涂在滤纸上，再滴加试剂，观察有无颜色出现。
A4.2 结果
在滴加1％盐酸二甲基对苯二胺溶液后，一般于15～20s内菌落即呈红色，然后逐步变成紫色，最后呈黑色。在混有杂菌的淋球菌分离平皿上，见到形态具有一定特征且氧化酶阳性的菌落，即可能是淋球菌。氧化酶试验，菌体形态和菌落形态是初步鉴定淋球菌的三个重要标准。
A4.3 注意事项。
为保证有良好的反应，使用的氧化酶试剂不应是过分陈旧的，如试剂已呈灰色或黑色则不应再使用。试剂配好后应放在棕色玻璃瓶中避光保存并尽快用完。氧化酶试剂遇铁也会出现红色，造成假阳性结果，所以操作用的接种环不可用旧铁丝制成。需传代的菌株应在菌落变黑之前挑取，一旦菌落变黑，多数菌已死亡。
A5 糖发酵试验
淋球菌具有分解某些糖类如葡萄糖的能力，使培养基中的指示剂的颜色发生改变。此外，淋球菌不能利用某些糖如麦芽糖，因而该糖发酵培养基颜色不变。
A5.1 糖发酵试剂的配制
A5.1.1 配制20％糖溶液，用过滤灭菌。
A5.1.2 配制缓冲平衡盐指示溶液（BSS）。
每1L中含磷酸氢二钾（K2HPO4）0.4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.1g、氯化钾（KCl）8.0g、酚红0.6g、pH7.1～7.2.过滤灭菌，贮于4℃备用。
A5.2 方法
A5.2.1 取5支小试管（70mm×10mm）。在1～4管中分别加入20％的灭菌葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖溶液0.05mL，第5管不加糖作对照。
A5.2.2 每管加入0.1mLBSS液。
A5.2.3 每管加入0.05mL菌悬液（淋球菌需用非选择性的巧克力琼脂培养，培养时间为20～24h，超过24h以上的较陈旧培养物可产生假阴性。用直径为3mm的白金耳挑取2满环菌混悬于0.4mLBSS中制成浓厚菌悬液）。
A5.2.4 充分混匀后置37℃水浴中孵育4h观看结果。
A5.3 结果
淋球菌能发酵葡萄糖，产酸，但不发酵麦芽糖、蔗糖和乳糖。因此，只有葡萄糖管的pH下降，颜色由红变黄，其他糖管颜色不变，保持红色。糖发酵试验用于淋球菌的鉴定。
A5.4 注意事项
用于发酵试验的糖类纯度要高。接种发酵管的菌要纯，如若混有杂菌，就会影响结果。由于淋球菌在普通营养琼脂中生长得不好，所以作淋球菌糖发酵的培养基中应加有动物蛋白如血清等。在使用胱氨酸胰酶琼脂（CTA）作糖发酵试验时，可用接种针将菌种入培养管的上三分之一。如将琼脂量由1％增加到1.5％，糖含量由1％增加到2％，则糖发酵试验的时间可缩短到4h.如将糖发酵管放到37℃水浴中，则看结果的时间可更短。
A6 荧光抗体染色法
抗淋球菌抗体标记荧光素后，与淋球菌结合时，可在荧光下见到发特异荧光淋球菌。
A6.1 方法
取病人分泌物或初代分离的培养物制成涂片，干燥后加热固定。将经稀释的淋球菌荧光血清滴加于涂膜上。置37℃湿盒内30min，使抗体与淋球菌结合。再用磷酸缓冲液充分洗去未结合之血清，用甘油封固剂封片，用荧光显微镜检查。
A6.2 结果
如是阳性标本，则在荧光显微镜下可见到发蓝绿色特异荧光的双球菌。
A6.3 注意事项
本法是直接荧光抗体染色法，标本制成后即可进行染色和观察结果，只有抗原抗体二种因子参加反应，所以方法简便、快速。但市售的抗淋球菌荧光抗体也可和脑膜炎球菌和某些其他的奈瑟菌起交叉反应；此外，也有些淋球菌菌株不与所用的抗血清起反应。反应温度一般为37℃，为加快反应可将温度提高到40℃。反应环境应有一定的湿度，否则干燥的抗体附着在玻片上会产生非特异荧光。封固剂中甘油的纯度要高，否则其产生的自发荧光会影响结果的正确判断。
