柱前衍生法测量游离脂肪酸含量的介绍
油脂水解产物中游离脂肪酸的检测主要利用气相色谱法, 但预处理步骤较为繁琐, 需要通过改变水解产物pH 值或利用薄层色谱预先将游离脂肪酸分离。柱前衍生HPLC 法测定游离脂肪酸不需要分离游离脂肪酸的前处理, 且HPLC 检测分离温度较低, 脂肪酸热降解程度大大降低, 具有气相色谱法无可比拟的优越性而得到了广泛的应用。利用柱前衍生HPLC 法测脂肪水解产物中游离脂肪酸的研究国外已有论文发表 。
一、实验仪器
Agilent -1100 型高效液相色谱、Zorbax SB -C18柱:美国安捷伦科技有限公司。
二、色谱条件
洗脱程序:初始流动相∶乙腈∶水(5∶95)经15 min梯度洗脱变化至100 %乙腈, 继续洗脱17 min ；体积流量1 .6 m L/min ；柱温:25 ℃；检测波长254 nm ；进样量20 μL , 利用外标法进行定量分析。
三、衍生化处理
准确称取等量的2 , 4 -二溴苯乙酮和18 -冠-6醚配制成一定浓度的衍生化溶液, 置于4 ℃条件下避光保存；分别称取肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亚油酸0 .164 、0 .333 、0 .772 、0 .286 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至100 mL 待用。取上述脂肪酸标准溶液0 .15 mL 于具塞反应管中, 加入相应浓度的衍生化试剂3 mL , 另加入0 .4 g 碳酸钾已形成pH值为8 .3 ～ 8 .5 的缓冲体系。混合物于80 ℃水浴中加热30 min , 反应液置于4 ℃条件下冷却1 h , 过0 .45 μm滤膜后, 待HPLC 分析。准确样品0 .15 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至10 mL, 加入1 g 无水硫酸
钠脱去酶解物中的水, 4 200 r/min 离心5 min , 取上清液0 .15 mL , 按上述中脂肪酸标准品衍生化步骤处理, 所得样品待HPLC 分析。
四、统计分析
选用OriginPro 7 .5 软件(OriginLab Corporation ,Northampton , USA)对数据进行单边方差分析(ANOVA)。显著性分析采用LSD 检验, 显著性水平采用0.05 。
