小鼠胚胎干细胞向神经干细胞的定向诱导分化
实验概要
小鼠胚胎干细胞向神经干细胞的定向诱导分化
主要试剂
无菌水、0.1%明胶、DPBS、0.05%Tripsin、fibronection、Laminin、细胞基础培养液、N2B27培养液、mES培养液C、小鼠EB培养基、神经干细胞培养液（NSC培养液）
主要设备
35 mm、100 mm培养皿、12孔板、移液枪、口吸管、玻璃管
实验步骤
（1）．经由EB分化法（Lee SH,2000）
①提前1 h用0.1%明胶包被35 mm培养皿，孵育1 h后弃去明胶。
②将在饲养层上培养的多能性干细胞以0.05% Trypsin消化2min，加等体积细胞基础培养液终止消化，1000rpm离心5min，弃上清并用神经干细胞培养液重悬细胞，以每皿2×105个细胞密度加入明胶包被的35 mm培养皿，在37℃、5%CO2培养箱中静置30 min，吸取上清以去除贴在明胶上的滋养层。
③把上一步骤吸取的上清液1000rpm离心5min，弃上清并用EB培养基重悬细胞，以每皿1×106个细胞的密度接种于100 mm培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中静置48 h。以后每天向每个100 mm培养皿中补加3mL EB 培养基。
！注意：培养皿接种后，要将细胞悬液充分摇匀后再放入培养箱，否则EB之间容易黏合在一起。
④分化第5天,在12孔板中每孔加入500μL 20μg/mL的fibronectin，室温静置过夜。
⑤分化第6天,弃去12孔板中的fibronectin，每孔加入1mL EB培养基。吸取100 mm培养皿中的EB球置入12孔板中，每孔放置20个左右EB球。
⑥.EB接种后第2天贴壁，弃去EB M，每孔加入2mL N2B27 培养液。以后每天半量更换新鲜的N2B27 培养液。
！注意：在12孔板中吸液和加液要轻，枪头紧贴皿壁，以免吹起EB球。
⑦ EB接种后第6天，此时可看见贴壁的球中爬出大量神经细胞，偶尔还可见神经元（图5-2B）
⑧.0.05%Tripsin消化2min，用等体积的10%FBS终止，1000rpm离心5min，用NSC M重悬细胞，并以每皿5×105个细胞的密度种植于35 mm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养。
⑨ 当细胞密度到达80%时进行传代，一般3-4d传代一次。经过几次传代后，神经干细胞以漂浮的神经球形式生长。吸取神经球，以每皿5×105个细胞的密度种植于提前包被PDL和laminin的35
mm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养扩增。PDL和laminin的包被方法为：在新的35 mm培养皿中每皿加入50μg/mL的PDL
1mL，室温静置过夜；第二天弃去皿中的PDL液体，用无菌水冲洗皿底3遍，室温静置晾干，每皿加入5μg/mL的laminin
1mL，37℃、5%CO2培养箱中静置过夜，接种前弃去laminin。
（2）单层培养分化法(Ying QL,2003; Xu J,2012)
①提前1 h用0.1%明胶包被35 mm培养皿，孵育1 h后弃去明胶。
②将在饲养层上培养的多能性干细胞以0.05%Tripsin消化2min，加入等体积10%FBS终止消化，1000rpm离心5min，弃上清并用PSC 培养基重悬细胞，以每皿2×105的细胞密度加入明胶包被处理后的35 mm培养皿，在37℃、5%CO2培养箱中静置30 min，吸取上清以去除贴在明胶上的饲养层细胞。
③把上一步骤吸取的上清液1000rpm离心5min，弃上清并用PSC M重悬细胞，以2×105每皿的密度接种于35 mm培养皿中
④ 小鼠胚胎干细胞在0.1%明胶包被的无饲养层条件下培养3代以上，每2天传代一次，传代时用0.05%的Tripsin消化1min，以等体积的10%FBS终止消化，1000rpm离心5min，mES培养液C重悬。
⑤按第④步的描述消化传代并以N2B27培养液重悬细胞，以每皿9.6×104个细胞的密度接种于弃去提前1h包被0.1%明胶的35 mm皿中，并加入1μM的RA。
⑥ 每日更换新鲜的加有RA的N2B27 培养液，4天后可见到花环状神经管结构（rosette）
⑦ 再过6天后传代并以NSC 培养液重悬，以每皿5×105个细胞的密度接种于提前包被了PDL和laminin的35 mm培养皿中，培养液为NSC培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养扩增。
