花粉管的胞吞胞吐速率和囊泡运输速度的研究
实验概要
本实验从植物花粉管的生长速度，花粉管的超微结构着手，用近似的模型结合几何学手段研究青杄和雪松花粉管的胞吞与胞吐速率,并用全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 观测其花粉管中分泌小泡的移动速度等。
主要试剂
1. 蔗糖、氯化钙和硼酸均用双蒸水溶解，然后按照所需浓度配制。
2. FM4-64的配制：5 mg的FM4-64 (分子量为607.5，购于Sigma)溶于2.5 mL的DMSO中，配成浓度为2.5 mg/mL (3.3 mM)的储存液，置于-20 ℃，用之前再用重蒸水进行稀释。
主要设备
JEM-1230电子显微镜 (JEOL Ltd. Tokyo，Japan)
实验材料
青杄、雪松花粉散粉之前采集成熟的孢子置于室温，过夜，待散粉后，用无菌干燥小瓶收集花粉，于-20℃保存备用。
实验步骤
1. 花粉培养
花粉于100%湿度的容器室温水合30 min后，以1 mg mL-1的浓度接种于液体培养基中。青杄、雪松花粉培养基含有12% 蔗糖，0.01% H3BO3，0.03% CaCl2。所有样品置摇床 (125 rpm )中，24℃恒温培养。
2. 花粉管生长速率的测定
青杄和雪松花粉分别离体培养15小时和36小时，每隔6小时取样。样品在Zeiss显微镜 (Axioskop 40)下选取已萌发的花粉进行拍照，以软件Axiovision测量花粉管的长度，每个样品至少测定300个花粉管，计算出平均长度和标准差。
3. 电镜观察
用2.5%的戊二醛和4%的多聚甲醛 (0.1 M的磷酸缓冲液pH 7.2配制，另加2%蔗糖) 固定材料，抽气，固定时间为3-4小时。然后用相同的缓冲液冲洗3次，而后再用1%锇酸进行后固定，固定时间为1-2小时。样品用系列乙醇冲洗，Spurr树脂包埋，60 ℃聚合16小时。用LKB-V切片机切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染后，在JEM-1230电子显微镜下观察、拍照。
1) 0.2M的不同pH值磷酸缓冲液的配制：
原液Ⅰ：将2.76克NaH2PO4·H2O或3.12克NaH2PO4·2H2O溶于100 mL蒸馏水中。
原液Ⅱ：将3.56克NaHPO4·2H2O或5.36克Na2HPO4·7H2O或7.16克Na2HPO4·12H2O溶于100 mL蒸馏水中。
将Ⅰ和Ⅱ依下表比例混合配制成不同pH值的PBS缓冲液。
pH | 0.2M原液Ⅰ (mL) | 0.2M原液Ⅱ (mL) | pH | 0.2M原液Ⅰ (mL) | 0.2M原液Ⅱ (mL) |
5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 | 92.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.0 61.0 | 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 39.0 | 7.2 7.3 7.4 7.6 7.8 8.0 | 28.0 23.2 19.0 13.0 8.5 5.3 | 72.0 76.8 81.0 87.0 91.5 94.7 |
2) 8%多聚甲醛的配制:称取0.8 g的多聚甲醛，加入10 mL 重蒸水，60 ℃水浴加热，直到几乎完全溶解，需要放置2-3小时才能使用，所以要提前配制。
3) 醋酸双氧铀染液配制：50%或70%酒精配制1-2%的醋酸双氧铀饱和液。遮光保存，下面有沉淀。有一定辐射性，但很弱，对人体影响不大。染色时，培养皿底部放置湿的滤纸，以防染液失水。染后，在3杯重蒸水中顺塑料条方向洗0.5-1分钟。染40分钟左右，中间加少量冲蒸水。
4) 檬酸铅染液配制： 0.1g NaOH(0.1M)溶于25 mL 重蒸水中，然后再溶入0.125 g柠檬酸铅，0.5% (容器30 mL即可，太大空间含CO2，易形成沉淀)，(轻)振荡、溶解、静置。染色时，现配现用，用时取中间部分。染时在大培养皿中放入NaOH，染30分钟左右。
5) 锇酸母液 (4%): 先将盛有1克锇酸的小瓶用洗衣粉洗干净，然后用双蒸水冲洗两次，放在干净的烧杯后置于冰箱中干燥。干燥后将盛有锇酸的小瓶放在50 mL棕色试剂瓶中，在通风柜内用玻棒打碎，加入25 mL双蒸水，加盖并密封，置于摇床上振荡过夜后，在4℃下保存备用。
4. 花粉管中囊泡运送速度的观测
1) FM4-64的装载: 方法参照Parton 等 (2001)，但略有改动。本实验中最终的FM4-64使用浓度为3 µM。FM4-64储存液用正常培养基稀释10倍。然后把培养20 h的青扦花粉管取100 µL至eppendorf管内，取1 µL稀释后的FM4-64加入100 µL的花粉管悬浮液内，使FM4-64的最终浓度为3 µM。
2) 全内反射荧光显微镜观测：全内反射荧光显微镜是在倒置显微镜 (IX81; Olympus)的基础上构建的。多通道氩离子激光发射器发出的光(458, 488, 515 nm; 30 mW) 通过单模块光纤维和三组照明镜头聚焦在高孔径物镜(Apo 1003 OHR; NA 1.65; Olympus)的背面，从而产生隐失波，允许样品表层的荧光被激发。FM4-64的激发波长为514 nm。荧光通过100倍油镜，530~600 nm滤光片，由电耦合CCD (Micromax, MMX-512-BFT; Princeton Instruments) 以200 ms/ 帧的速度收集time-lapse图像序列。
5. 数据分析
1) 胞吞胞吐的计算：将花粉管看成是圆柱形，其顶端是半球体，将花粉管的生长可看成是一种匀速的生长。设定除了纤维素外，所有壁体积的增加都完全来自于胞吐小泡所携带的物质。这些物质在壁上沉积并不改变其体积，只是改变了形状。因此采用Image J 1.34e (Wayne Rasband, National Institutes of Health)测出超薄切片下的花粉管的为花粉管壁厚度w，花粉管内径D，胞吐小泡的直径d等数据，根据单位时间内增加的细胞壁体积等于单位时间内的胞吐体积：
dVcellwall = Nexo Vexo (Nexo为单位时间内胞吐小泡的数量；Vexo为胞吐小泡的体积)。
Vexo可通过小泡的直径来计算：
Vexo =p d3exo / 6 (d为胞吐小泡的直径)。
单位时间内增加的细胞壁体积为：
dVcellwall = [p( D 2w )2 - pD2] v/4 =pw( D w ) v (w为花粉管壁厚度)
所以Nexo = Vcellwall / Vexo =6w( D w ) v/ d3exo.。
而胞吞的速率可以根据胞吐的增加的膜面积减去胞吞的膜面积等于花粉管增加的膜面积来计算：dAmembrane = Nexo Aexo – Nendo Aendo，
2) 囊泡的运动速度：全内反射荧光显微镜采集的图像分析使用软件Image-Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics), Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems), and Image J 1.34e (Wayne Rasband, National Institutes of Health)。
