Nif对白皮松花粉管细胞壁构建的影响
实验概要
本实验研究了钙通道抑制剂Nif处理对花粉管细胞壁主要成分的分布及含量的影响。
主要试剂
1. 0.1%无色水溶性苯胺蓝：0.1 g水溶性苯胺蓝，用0.15 M K2HPO4(pH 8.2)溶解。新配制的溶液有色，碱性条件下经过数小时变成脱色溶液即可使用。
2. Calcofluor (fluorescent brightener 28，Sigma F-3543，UK)用双蒸水溶解，终浓度为10 mg/ml，10000g离心，4℃避光保存备用。
3. 100 mM PBS缓冲掖：分别称取NaCl 8.0 g, KCl 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，依次溶解于800 ml双蒸水中，用1 N HCl调pH 7.2，定容至1000 ml。
4. PME缓冲液：100 mM PIPES，1 mM MgCl2，2 mM EGTA，pH 6.8：分别称取PIPES 3.02 g，EGTA 0.076 g，MgCl2 0.0204 g，用双蒸水溶解，调pH 6.8，加双蒸水定容至100 ml。
5. 3%多聚甲醛固定液：3 g多聚甲醛，加入50 ml双蒸水，50-60℃下加热 30 min，用少量1 N NaOH调pH 6.9，搅拌溶解。然后加入上述PME缓冲液(pH 6.8)，定容至100 ml。
6. 抗体：JIM5(识别酸性果胶质，Acidic pectins)、JIM7(识别甲酯化果胶质，Esterified pectins)、LM2(识别阿拉伯半乳聚糖蛋白)、LM6(识别阿拉伯半乳聚糖蛋白)单克隆抗体购自University of Leeds, UK；JIM13(识别阿拉伯半乳聚糖蛋白)。结合FITC的羊抗大鼠IgG抗血清(fluorescein isothiocyanate-labeled sheep anti-rat IgG antiserum)购于Sigma。抗体均在-20℃下避光保存，使用时用pH 7.2的PBS稀释10倍。
7. 蛋白提取液：65mM Tris (pH 6.8)，1% SDS，5% 甘油，2.5% β-巯基乙醇和0.01%溴酚兰。
主要设备
荧光显微镜(Axioskop 40，Zeiss，Germany)
Spot П 照相机(Diagnostic Instruments Inc.)
实验材料
白皮松花粉
实验步骤
1. 材料培养
分别称取10mg白皮松花粉，置于以下两种培养基，25℃条件下摇床(120rpm)暗中培养72h。培养基中所含DMSO浓度低于1%，该浓度对于花粉萌发和花粉管生长无影响。
1) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 (CKM)
2) 15%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01%CaCl2 250µM /500µM Nif
2. 花粉管细胞壁中纤维素的标记
将Calcofluor溶液于14000g离心5min，取上清液与培养液按1：10混匀，暗中孵育45min，荧光显微镜下观察，数字图像用Spot П 照相机采集，并在明场下采集黑白图像。
3. 花粉管细胞壁中胼胝质的标记
1) 取材：不同处理培养84 h的花粉管用3%多聚甲醛固定液冲洗过滤；
2) 在含3%多聚甲醛(paraformaldehyde)的PME固定液中真空抽气5-10 min，室温下固定1 h；
3) 去掉固定液，100 mM PBS缓冲液(pH 7.2)洗3次，每次10 min；
4) 样品与0.1%无色水溶性苯胺蓝(aniline blue)室温下孵育5-10 min；对照：样品与100 mM PBS 缓冲液孵育；
5) 0.5%甲苯胺兰(toluidine blue O)(用1 mM PBS配制，pH 7.0)处理10 min，消除非特异性染色；
6) 将材料装载于载玻片上，并滴加0.2% 的抗荧光淬灭剂；
7) 在装有365-400λ滤光片的紫外光学显微镜下观察、拍照。
多聚甲醛可以快速地固定花粉管细胞壁成分，并能良好地保持花粉管形态。为检验多聚甲醛对标记造成的可能假像(artefact)，另设不固定的花粉管作为对照。两种操作都将胼胝质标记在细胞壁相同的位置上，并且荧光强度没有明显差别，说明多聚甲醛固定材料在本实验中没有产生假象。
4. 花粉管细胞壁中果胶质免疫荧光标记
1) 不同处理培养84 h的花粉管用3%多聚甲醛固定液冲洗过滤；
2) 在含3%多聚甲醛的PME固定液中真空抽气5-10 min，室温下固定1 h；
3) 去掉固定液，100 mM PBS缓冲液(pH 7.2)洗3次，每次10 min；
4) 单克隆抗体JIM5和JIM7均用100 mM PBS以1：5的比例稀释，室温下与样品避光孵育2.5 h；
5) 100 mM PBS洗3次，每次10 min；
6) 与结合FITC的二抗(1：100稀释于PBS中)在室温下避光孵育2 h；
7) 100 mM PBS洗3次，每次10 min；
8) 装载于载玻片上，并滴加0.2% 的抗荧光淬灭剂；
9) 激光共聚焦扫描显微镜(BIO-RAD， USA，MRC1024，Kr/Ar 激光，激发波长488nm，发射波长522nm)下观察并采集图像，同时，于光纤二通道下采集明场图片。
对照1：用100 mM PBS代替一抗JIM5或JIM7；
对照2：用100 mM PBS代替二抗FITC-IgG，按上述操作同时进行。
5. 傅里叶显微红外光谱分析(Fourier Transform Infrared spectroscopy，FTIR)
1) 不同处理培养84 h的花粉管用去离子水充分冲洗；
2) 样品-20℃贮存待测或立即进行下面的操作；
3) 样品置于BaF2晶片(Barium fluoride window)上，50℃下充分干燥30 min，烘干水分；
4) 在装有MCT检测器及显微镜的Perkin-Elmer Cetus MAGNA 750 FTIR 光谱仪(Nicolet Corp., Tokyo, Japan)记录FTIR光谱，光谱分辨率8 cm-1，测量范围2000-800 cm-1，扫描次数128次；
5) 取适宜吸收波数(wave numbers cm-1)用Excel 作图并分析，y轴数据设为相对吸光度(Absorbance)。
6. 阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan-proteins, AGPs)免疫荧光标记
一抗为单克隆抗体LM2、LM6和JIM13，其余按与果胶质免疫荧光标记相同的步骤操作。
7. 细胞壁蛋白的凝胶电泳分析
1) 收集白皮松花粉粒及不同处理培养84 h的花粉管，液氮研磨；
2) 加入预冷的50 mM磷酸缓冲液 (pH 6.0)，0℃下10000g离心15min，收集沉淀；
3) 用预冷的50 mM磷酸缓冲液冲洗沉淀物；
4) 用预冷的重蒸水冲洗沉淀物，0℃下500g离心5min，收集沉淀，重复8次；
5) 用预冷的1% Triton X-100冲洗沉淀物，0℃下500g离心5min，收集沉淀，重复2次；
6) 用预冷的重蒸水冲洗沉淀物，0℃下500g离心5min，收集沉淀，重复8次；
7) 加入预冷的1M NaCl溶液，在4℃下放置2h，中间摇动数次，0℃下12000g离心10min，收集上清液；重复2－3次，合并上清液，装入透析袋；
8) 用500 ml预冷的50 mM磷酸缓冲液 (pH 6.8)透析48h，中间换两次缓冲液；
9) 用200 ml 10% PEG20000(溶解于50 mM磷酸缓冲液，pH 6.8)浓缩24h；
10) 用预冷的50 mM磷酸缓冲液 (pH 6.8)将样品从透析袋中洗出，离心，收集上清液，分装备用。
11) 蛋白质浓度用Bradford法测定。
12) SDS-PAGE采用12%凝胶，凝胶厚度为1.0mm，缓冲系统参照Laemmli，银染。
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项目成果
