表面功能化纳米颗粒的特征光谱分析（二）
荧光检测
按照表1的参数用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机检测样本的荧光值。在初步扫描中，氧化铁纳米颗粒对照和包被样本以260 nm激发，以5 nm 步进在295nm至750 nm范围扫描发射光谱。氧化锌纳米颗粒样本则以350 nm 激发，5 nm 步进在375 nm至750 nm范围扫描发射光谱(表1)。读板前微孔板以回旋振荡方式高速振荡5秒钟。完成初步验证后，按照用户定义的激发光和发射光范围使用光谱优化向导(Spectral Optimization Wizard，SOW)进行一系列的荧光值读取，并获得每个样本的最佳波长组合。SOW可按照表2的设定进行初始化。点击Read后会弹出一个新的对话框让用户确定激发和发射波长的测试范围。此次实验中激发波长的扫描范围为250到500 nm，发射波长范围为300到700 nm。对于氧化铁纳米颗粒样本，扫描步进为10 nm。对于氧化锌纳米颗粒样本扫描步进则为5 nm。对所有的样本读取高度为默认1 mm。参数对话框参见图2。
数据采集
光谱优化向导旨在识别样本的最佳激发和发射波长组合并以此为基础进行后续的检测。软件本身不会自动保存分析热图和相关荧光值数据。但是，我们可以在热图窗口打开的情况下，右击热图，选择复制原始数据(Copy Raw Data)，并粘贴到合适的软件中，做到原始数据的导出。如果原始数据是导出到电子表格，因为软件没有自动输出原始数据能力，必须手动输入扫描中使用的激发和发射波长参数。扫描中的原始热图可以通过在Softmax Pro软件中右键，选择图片另存为(Save Image As)的方式导出。
结果
在260nm波长激发，580nm波长发射组合下，氧化铁纳米颗粒具有最高的荧光值(10.1K相对信号强度，图3，顶图)。在mPEG包被下，氧化铁纳米颗粒的最高荧光值为5.1K，此时激发波长为270 nm，发射波长为570nm(图3，底图)。因此，相较于没有包被的对照样本，mPEG包被引起最佳激发和发射波长10 nm的迁移。由于光谱预扫描中采用的是10 nm步进，因此所观察到的微弱迁移可能是来源于测量变异。但是近乎一半的荧光强度下降表明一些微弱的相互作用，即使到了结合解离平衡阶段，也会引起显著的荧光淬灭。相比下，氧化锌纳米颗粒在390 nm波长激发，670 nm波长发射下具有最强的荧光值13K，图4，顶图)。在mPEG包被下，氧化锌纳米颗粒最佳波长组合变为380 nm波长激发，695 nm波长发射，此时荧光值为95.6K(图4，底图)。因此，在5 nm 扫描步进下，mPEG包被能引起25 nm最佳发射波长的迁移，说明mPEG多聚物和氧化锌纳米颗粒表面存在相互作用。因为mPEG的结合会改变表面原子的电子性质。同时荧光信号的增强表明存在多聚物和材料中氧分子的相互作用。表3总结了上述的光谱扫描结果。
总结
测试中观察到的20 nm 激发和发射波长位移表明氧化锌纳米颗粒和mPEG多聚物之间出现了静电相互作用，相比下mPEG处理则不能引起氧化铁纳米颗粒的光谱特征改变。在此，我们展示如何通过结SoftMaxPro软件的光谱优化向导，用SpectraMaxi3x多功能微孔板读板机进行纳米颗粒的表征和其表面相互作用的分析。该方法不仅可以用于质控纳米分析表面功能化过程，还可以进一步在利用纳米颗粒为载体运送靶向治疗化合物的药物开发过程中确保产品的正确包装。
