cDNA 文库的构建（一）
实验材料 λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物
试剂、试剂盒 放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶RNase 抑制剂用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸T4 噬茵体多核苷酸激酶大肠杆菌 DNA 聚合酶 I酚氯仿乙酸钠T4 噬菌体 DNA 聚合酶大肠杆菌 DNA 连接酶EcoRlβ-疏基乙醇溴酚兰
仪器、耗材 微量离心管水浴箱SephadexG-50 离心柱过滤的压缩空气止血器或软管夹带有弯头的皮下注射针头无菌吸管聚乙烯管剪刀Sepharose CL-4B乙烯基泡沫管Whatman3 MM 滤纸
实验步骤
阶段 1: 反转录酶催化合成 cDNA 第一链
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
放线菌素 D:
只在使用带有 RNaseH 活性的野生型 Mo-MLV 反转录酶时才需要用放线菌素 D。见第 7 章信息栏“放线菌素 D”。
二硫苏糖醇（DTT 1mol/L)
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
KCl(1mol/L)
MgCl2(1mol/L)
Tris-Cl(1mol/L, 室溫 pH8.3)
酶和缓冲液
反转录酶
有数家厂商供应重组的鼠源反转录酶。我们强烈推荐没有 RNase H 活性的突变体酶（如 Life Technologies 公司产的 SuperscriptⅡ反转录酶)。正如在信息栏“Mo-MLV 反转录酶”中所讨论的，反转录酶制剂的比活决定于在大肠杆菌表达此酶所用的特定 cDNA 克隆, 有关酶的情况可査阅每一个厂商的说明书（如每微克 poly（A）+RNA 加入的酶单位数，反应温度）。更多的资科参见本方案结尾处的疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应-20°C 保存直至步骤 1 需用前才取出。
RNase 抑制剂（选用）
RNase 的蛋白抑制剂可与大多数 RNase 结合并抑制它们的活性，但并不影响 Mo-MLV RT 中的 RNaseH 活性。几家厂商销售这些抑制剂，并给以不同的商品名称。（如 Promega 公司产的 RNAsin 和 5prime→3prime 公司产的 Prime Inhibitor)，详见第 7 章信息栏“RNases 抑制剂“。
核酸和寡核苷酸
dNTF 溶液，含有所有四种 dNTP，每种浓度为 5 mmol/L
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物（1mg/ml)
通常用随机六核苷酸和 oligo(dT）12~18 或者这两种引物的混合物引发 cDNA 第一链的合成。对定向克隆, 通常使用引物-衔接子，其一般结构为 5'P(dX)-(dR)-(dT)x-OH3', 这里 X 由 4 个核苷酸组成（通常为 GAGA)，R 为限制性内切梭酸酶识别位点，（dT)x 为用于定向克隆的由 15(dT) 残基组成的多聚物。Oligo(dT)12-18 以 10 倍（Mo-MLV H-) 和 40 倍（Mo-MLV) 过量的摩尔数存在于第一链合成的反应混合物中，与随机六聚体和引物-衔接子（见下文）不同，Oligo(dT)12-18在反应混合物中的浓度通常不需要优化。随机六聚体在反应混合物中的浓度是很关键的。随着六聚体与 mRNA 比率的增加，cDNA 平均长度随之减少。所以在一系列含有放射性标记 dCTP 的预备实验中优化随机引物和 mRNA 模板的比例是必需的。在每一个预备实验中所产生的 cDNA 第一链的平均长度应当用巳知分子质量大小的 DNA 参照物作对照，通过碱性琼脂糖凝胶电泳和放射自显彩进行检测，当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大 cDNA 平均长度的最高随机引物与 mRNA 比。
使用引物-衔接子一般比使用随机引物引起的麻烦少，但是在一系列含有放射性标记的 dCTP 的预实验中，仍然需要慎重地优化引物-衔接于与 mRNA 模板的比例，每一反应中所合成的 cDNA 量按照本方案步骤 5 和 6 所述方法进行测量。当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大产量 cDNA 时的最低引物-衔接子与 mRNA 比。
制备引物贮存液（1 mg/ml,10 mmol/LTris-HCl[pH7.4] 配制），将溶液分装，贮存在-70°C。
poly(A)+RNA(1 mg/ml)
合成足量双链 cDNA 以构建大的文库时，一般需要 5~10ug poly(A)+RNA(—个 90 mm 大小的方瓶，培养哺乳动物细胞长成致密单层可产生 1~2ug poly(A)+RNA)。如果棋板用量较少，仍可有效地进行合成反应，但方案中毎一阶段 cDNA 的损失将成比例增加。当用有限数量的细胞制备文库时，参见本章末信息栏“从少量细胞构建 cDNA 文库"。
在开始构建 cDNA 文库前，应当用下述方法对所用 poly(A)+RNA 的完整性进行检査。（1）琼脂糖凝胶电泳和用对照探针进行 Northern 杂交（见第 7 章方案 5 和 8）。（2）在无细胞翻译系统中进行翻译，对产生的多肽进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。（3）对预实验反应中合成的 cDNA 第一链的大小进行分析 (见本方案末疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”）。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dATP 和 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第一链和第二链合成的放射性示踪剂，因为它们偏爱掺入到对应 mRNA3'端 poly(A)+尾的 cDNA 中。在本方案中，不要使用贮存超过两周的 [a-32P]dCTP。
在开始本方案前，才能冻融 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 2 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
重要：Stratagene 产的 cDNA 合成试剂盒中推荐，在其方案中除不能用 dCTP 外，任何标记物都可以使用。试剂盒内的 dNTP 混合物中含有 5-甲基 dCTP, 这样可保护cDNA 内郁的 XhoⅠ识别位点不被 XhoⅠ降解，因为 XhoⅠ常用来产生供连接用的 XhoⅠ末端。在 Stratagene 公司的方案中使用放射性标记的 dCTP, 可在 cDNA 内部产生不能被保护的 XhoⅠ位点。
专用设备
微量离心管，无 RNase
预设温度为 16°C 和 70°C 水浴
附加试剂
本方案步骤 5 所需试剂列在第 5 章方案 8。
方法
1. 在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行 cDNA 第一链的合成:
poly(A)+RNA(1ug/ul) 10ul
寡核苷酸引物 (1ug/ul) 1ul
1mol/LTris-HCl(pH8.0,37°C) 2.5ul
1mol/LKCl 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 毎种 5 mmol/L) 10ul
0.1mol/LDTT 2ul
RNase 抑制剂（选用） 25 单位
加 H2O 至 48ul
然后在反应物中，加人厂商推荐的 Mo-MLV H- RT 的用量，温和振荡混合反应物反转录酶是用含 Triton X-100 或 NP-40 和 50% 甘油的缓冲液配制的，因此避免气泡产生有时是困难的，但应尽量避免产生气泡，必要时，可用微量离心机稍稍离心一下，除去气泡。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应保存在-20°C。直到需要使用为止。
重要：如使用 AMV RT 制剂，反应条件见表 11-3。
2. 当所有反应组分在 0°C 混合后，取出 2.5ul 反应液转移到另一个 0.5 ml 微量离心管内。在这个小规模反应管中加入 0.1ul[a-32P]dCTP(400Ci/mmol,10mCi/ml)。
3. 大规模和小规模反应管都在 37°C 温育 lh。
对于某些 Mo-MLV RT 突变体，可采用较髙的温度（高至 55°C）。若 mRNA 含有广泛的二级结构，较高的温度下反应能增加 cDNA 合成的产量。然而，在 55°C 合成的 cDNA 平均长度较在 37°C 合成的短。
4. 温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入 1ul 0.25mol/LEDTA, 然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在 70°C 温育 10 min, 然后转移至冰上。
在大规模反应管中所合成的 cDNA 可直接用作 PCR 反应的模板。如果 cDNA 第一链用作合成 cDNA 第二链的模板，应在进行步骤 5 和步骤 6 同时，准备好第二链合成所需材科和 16°C 水俗。
5. 按附录 8 所述方法，测定 0.5ul 小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸 (TCA) 沉淀的放射性活度。此外，用合适的 DNA 分子质量参照物通过械性琼脂糖凝胶电泳（参阅第 5 章方案 8) 对小规模反应产物进行分析是值得的。
cDNA 第一链应呈大小约 0.7kb 到 6kb 以上的拖影，多数在 2kb 左右。
小规模反应残留物保存在-20°C。
6. 按下述方法计算 cDNA 第一链的合成量：
a. 在大规模 cDNA 合成反应中，使用 10ul 含有 4 种 dNTP 的溶液，每种 dNTP 浓度为 5 mmol/L(即 10ul 20 mmol/L 总 dNTP) 所以大规模反应中必定含有
20nmol/ul dNTPx10ul=200nmol dNTP
b. 因为渗入到 DNA 中的每种 dNTP 的分子质量大约是 330 g/mol, 因此反应所能产生的 DNA 总量为：200nmolX330ng/nmol=66ugDNA。
c. 根据小规模反应的结果，计算所得 cDNA 第一链合成量为
如反应良好，cDNA 第一链的产量应是反应混合物中所用 poly(A)+RNA 量的 30%~40%。
另一种监视 cDNA 第一链合成情况的方法是在上面所述的大规模反应中，加入少量 [a-32P]dCTP(总量为 10uCi)。在随后 cDNA 的第二链合成反应中，加入更大量的放射性标记的 dNTP, 总置为 100uCi,—般不希望采用这种方法，因为随后必须将碱性琼脂糖凝胶于 X 射线胶片上长时间曝光以获得 cDNA 第一链产物的合适成像。
