RNAi-制备小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs)的方法-2
越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering
RNAs，siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的
mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference
pathway）。RNAi的应用包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信号传导通路分析等等。
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括
化学合成
体外转录
长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
前面3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法，优点和缺点，以及它们最适合的应用。
siRNA的设计
除了方法3以外，其他的方法都在制备siRNA
前都需要单独设计siRNA序列。关于怎样设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是精确的。通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的siRNA设计工具。
体外制备
1.化学合成
尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs
的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选 siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer
siRNA Construction Kit为例，一旦得到DNA
Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果（0.5-20
nM vs. 50-100 nM per transfection）
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs
“混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA
，然后用RNase III (or Dicer)
在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse
III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。Ambion公司曾经用它的Silencer
siRNA Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成功关闭几个基因，包括c-fos, GAPDH, La, ß-actin,
和Ku-70。
