关于小干扰RNA的siRNA设计介绍
最初，siRNA序列的选择是基于实验经验而获得的（Elbashir et al. 2001，2002）。最近，生物信息学工具被用来设计siRNA（表18-1），目前多个数据库收录了经过实验确证的siRNA和shRNA。值得推荐的是，在设计新的siRNA之前可以通过搜索已有的siRNA数据库和科研文献来寻找已确证的siRNA。如果不能获得已确证的siRNA，则应该为每个靶基因设计3~5条候选siRNA（Pei and Tuschl 2006）。以下将介绍如何挑选有效和特异性强的siRNA。有关siRNA设计的详细过程请参考Birmingham等（2007）的研究。
1、目标区域。siRNA通常以mRNA的CDS序列为靶点，因为一般认为，相对非编码序列而言，CDS序列容易成为RNA干扰的靶点且多态性更低。然而，当CDS不容易找到合适的siRNA结合位点，或者为了区分两个编码区相同但3'非翻译区（UTR）不同的基因时，3'端UTR也可以利用。5'端UTR和剪接点通常不被考虑，因为它们可能会被细胞内蛋白质复合体（如翻译起始机器或者外显子连接复合体）所包裹。
2、长度和非配对结构。尽管20~25个核苷酸长度、包含2个非配对碱基形成的3'端突出“尾巴”的双链siRNA显示出了与常规siRNA相当的效率，但常规的双链siRNA依然是长度为21个核苷酸、两端包含2个非配对碱基形成的3'端突出“尾巴”，模拟了Dicer酶体内切割的主要产物。长度超过30个碱基的双链RNA能够在哺乳动物体细胞中诱导干扰素反应。一些长度超过23个碱基的RNA双链体能够诱导细胞特异性的干扰素反应（Reynolds et al. 2006）。
3、热力学不对称性。进入RISC的siRNA链被称为“向导链”（图18-2）。这一siRNA链的5'端碱基配对较为松弛（动力学稳定性稍差），被RNA干扰机器识别为向导（Khvorova et al. 2003；Schwarz et al. 2003）。向导链进入RISC，两者之间的这种结合会通过5'端的G∶U错配得到加强。反之，也可以通过化学修饰减弱信使链（向导链的反义链，目标mRNA的同义链）与RISC的结合（Nykanen et al.2001；Chen et al. 2008）。
4、GC含量和核苷酸偏好。有关siRNA设计的大量分析显示：具有生物学功能的siRNA不能含有回文（palindromic）序列和内在重复序列，并且GC含量达到30%~52%。回文序列或者内在重复序列会形成二级结构，干扰与RISC以及目标mRNA的结合（Patzel et al. 2005）。GC含量过高或者过低会干扰两条siRNA链的分离，减慢与RISC的结合。此外，成熟RISC与目标mRNA的强烈结合会妨碍切割产物的释放，使酶的转换效率降低（Haley and Zamore2004；Tang and Zamore2004）。有关高效siRNA性质的多因素分析显示：向导链的第1~第7个碱基应该是U或者A，第10个碱基应为A或者U，第19个碱基应为G或者C（Pei and Tuschl 2006）。这些“规律”预示了向导链的结合喜好，使其与靶标保持适当的亲和力，促进对靶标的多轮切割。
5、RNA干扰介导的脱靶效应。RNA干扰介导的脱靶效应是指双链siRNA的向导链或信使链介导的对基因表达的非特异性抑制，具有浓度依赖性（图18-3）（Jackson et al. 2006a）。RNA干扰介导的脱靶效应通常会在siRNA发挥类似内源性miRNA的作用时发生，即通过小RNA向导链的“种子序列”（2~7位或2~8位核苷酸）与其目标mRNA结合（Lim et al. 2005；Lin et al. 2005；Birmingham et al. 2006）。目前已经有多种消除这种脱靶效应的方法。尽管通过同源性搜索（如BLASTn或者Smith-Waterman算法）来减少可能存在脱靶效应的siRNA的方法应用比较广泛，但这一方法仍不能消除大多数的脱靶效应，这是因为无法避免第6位和第7位核苷酸与细胞内mRNA匹配的偶然情况。通过将针对同一mRNA的多个无相关性siRNA混合使用以降低每一种siRNA浓度的方法可提高RNA干扰的特异性（Kittler et al. 2007），但是这种方法有着严格的适用要求。对siRNA向导链的第2位核苷酸进行不依赖于序列的化学修饰同样可以提高效率，这一方法减少了siRNA对既定靶标以及靶标之外mRNA的亲和力（Jackson et al. 2006b）。唯一被证实的可提高RNA干扰特异性的方法是设计siRNA分子，使其正确的RNA链进入有功能的RNAi酶复合体，或者可以对信使链进行化学修饰，以阻止其通过RNA干扰途径发挥作用（Elménet al. 2005）。
6、天然免疫反应和毒性。在哺乳动物中，如果siRNA包含富含G和U的序列基序，如GUCCUUCAA或者UGUGU，那么此siRNA有可能通过Toll样受体激活细胞内的天然免疫通路（Hornung et al. 2005；Judge et al. 2005；Marques and Williams 2005；Sioud 2005）。然而，其他的免疫刺激因素仍然有待鉴定，因为有一些siRNA虽富含G和U却不能激活免疫受体，而另一些缺少GUCCUUCAA或者UGUGU基序的siRNA反而具有免疫刺激活性。针对176个随机挑选的siRNA进行比较研究，鉴定出UGGC是一个毒性基序，能引发细胞死亡（Fedorov et al. 2006）。已知的免疫刺激活性和毒性基序可以通过计算预测而避免。另外，化学修饰，如锁状核酸（locked nucleic acid，LNA）（图18-4）和对免疫刺激活性和毒性基序进行2'-O-甲基化核酸修饰可以用于抑制其天然免疫刺激活性（Judge et al. 2006）。
