杂交瘤技术基本程序与方法-9
（1） 有限稀释法
材料：
a、96孔细胞培养板等；
b、HT培养基；
c、活力强的杂交瘤细胞；
d、小鼠腹腔细胞。
方法：
a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。
b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。
c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e、37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。
（2）软琼脂法
材料：
a、HT培养基（双倍浓度）。
b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。
c、小鼠腹腔细胞。
d、灭菌平皿。
e、45℃水浴。
f、活力很好的杂交瘤细胞。
方法：
a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。
b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。
c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。
d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。
e、37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。
f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。
5、杂交瘤细胞的冻存与复苏
（1）杂交瘤细胞的冻存
在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃?? -20℃，每分钟下降1℃；-20℃??
-40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在
80%以上。
①材料：
a、带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b、含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c、灭菌安瓶或带盖小瓶。
d、-70℃冰箱。
e、液氮及液氮罐。
f、处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
②方法：
a、将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b、安瓶封口后仍置冰浴上。
c、将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d、2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e、液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等
