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水稻根尖染色体标本制备

2019.4.28

1.取材: 选取水稻种子,充分浸种后,将它们摆在铺有滤纸的培养皿内,在约28℃条件下发芽培养,当胚根长至1~1.5cm时,剪下备用。
2.预处理 
压片法:采用0.1%秋水仙素处理2h左右
去壁低渗法可采用以下四种方法处理
处理方法 0.002mol/L8-羟基喹啉 α-溴萘饱和溶液 低温(-4℃) 卡诺氏Ⅰ固定液
处理时间(h)                 1                   24               24             24 
注:卡诺氏Ⅰ固定液 乙醇:冰醋酸(3:1)
3.固定 卡诺氏Ⅰ固定液,固定时间以不超过24h为宜。
经过固定的材料如不及时使用,可经90%酒精换到70%酒精各半小时,再换入一次70%酒精,在0~4℃冰箱内备用。
去壁低渗法
a.将3固定的材料用DDW洗净后,0.075mol/LKCL溶液室温条件下处理约30min。
b.酶解去壁 吸取低渗液,加入1%混合酶液(1%果胶酶与1%纤维素酶的混合液,均为Sigma公司),28℃左右,酶解4.5~5h.酶解过程中,将材料瓶轻轻摇动1~3次,使材料与酶液充分接触。
c.后低渗 吸取酶液,用DDW冲洗材料2~3次,然后在DDW中停留30min。
d.重固定 吸取低渗液后,加入新配制的卡诺氏Ⅰ固定液,固定时间约20min。
e.标本制备 吸取固定液后,将根尖捣碎,再滴入新鲜固定液3~5滴,制成细胞悬液,充分搅匀。吸出细胞悬液滴于清洁载玻片上。(为了使细胞悬液能充分散开,载玻片可预先放置于-20℃冰箱内保存,使用时取出)再将载玻片于酒精灯下来回移动,烤片。
f.染色 改良品红[11]染色30~50min。染色完毕,洗去染液,脱水透明,干燥后镜检。
根尖压片法
解离: 将1.3固定好的材料用DDW冲洗2~3次,放入盛有1N盐酸(浓盐酸:DDW 1:11)的小瓶中,在60℃左右水浴锅中处理15min。解离完毕时,根尖分生区是乳白色,而根冠和伸长区则显透明。
染色: 将材料水洗3~5次,注意,一定要将解离液冲洗干净,否则材料不易着色。改良品红染色约5h。
压片: 取染色完毕的根尖置于干净载玻片上,切除根冠,切下根尖分生区,加入一滴清水,盖上玻片后压片。镜检,如果染色过深,可滴加一滴45%醋酸溶液分色。
 

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