人外周血染色体制备和体外培养细胞的染色体标本制备
实验概要
本文介绍了人外周血染色体制备和体外培养细胞染色体标本制备的原理、操作流程及注意事项。
实验原理
人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。
在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
主要试剂
1. 培养基的配制：
RPMI 1640培养基 4ml
小牛血清 1ml
青霉素和链霉素 各100IU/ml
PHA 0.2ml
肝素 1小滴
以5% NaHCO3调pH至7.2～7.4, 4℃备用。
2. 肝素：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，灭菌。
3. 秋水仙素：生理盐水配制成20μg/ml浓度，灭菌，分装，置－20℃。
4. 低渗液：0.075mol/L KCl。
5. 固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1），临时配制。
6. Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸缓冲液，临时配制。
7. 磷酸缓冲液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等体积混合。
8. 5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
主要设备
1. 2ml注射器、培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20min。
2. 离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。
3. 超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。
实验材料
人外周血
实验步骤
1. 人外周血染色体制备
1) 接种，培养
a.在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血1～2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。
b.无菌条件下，将肝素化血液滴入至外周血培养基内，每5ml培养液内滴入血滴28～30滴（7号针头）轻轻混匀。
c.置37℃恒温箱内，静止培养68～72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。
d.终止培养前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象。
2) 制片
a.收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。
b.低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml，反复吹打（约一百次）后，置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。
c.预固定：加入新鲜制备固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），轻轻混匀。
d.离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。
e.固定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定10min。
f.离心：同上，吸去上清液。
g.再固定：加固定液8ml，混匀，固定10min。
h.离心：同上，吸去上清液。
i.制细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液。
j.滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约750px距离进行滴片，每片约滴2～3滴细胞悬液，使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3～5张标本片。
k. 染色：标本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干。
3) 镜检：人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
2. 体外培养细胞的染色体标本制备
1) 体外培养的细胞，在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞（传代后24h，圆形发亮的细胞）时，加入秋水仙素溶液，终浓度为0.3μg/ml培养液；
2) 继续培养3h；
3) 胰酶消化收集细胞至离心管；
4) 离心1000转/min，离心10min，去上清；
5) Hanks液洗，离心，去上清；
6) 低渗处理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒温水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；
7) 固定及制片如外周血染色体的制备。
注意事项
1. 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
2. 固定液应在使用前临时配制。
3. 载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
4. 染色体分裂指数低：患者处于非常时期（放、化疗期）；培养基营养成分不良；培养基pH偏低或偏高；PHA过量或不足；小牛血清质量不高；培养箱温度偏低；秋水仙素处理时间过短。
5. 接种的血样愈新鲜愈好。
6. 培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。
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