| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙醇
异丙醇
DNA提取液
碱性裂解液Ⅰ，预冷
碱性裂解液Ⅱ
碱性裂解液Ⅲ，预冷
STE溶液，预冷
TE ( pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
脉冲场凝胶电泳仪
4. 培养基
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基
5. 核苷酸与寡核苷酸
脉冲场凝胶电泳所需的 DNA 标准参照物
6. 离心机与转头
Sorvall SS-34 转头或同类产品
7. 专用设备
层析树脂
8. 载体和菌株
BAC 转化的大肠杆菌
二、方法
1. 用 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基培养 BAC 转化的大肠杆菌，37℃ 剧烈振摇过夜。
2. 4℃ 下，2000 g ( 用 Sorvall SS-34 转头，4100 r/min ) 离心 5 min, 收集细菌。小心弃去培养液，用吸头吸净残液。
3. 在每个离心管中加 5 ml 预冷的 STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤 2 离心收集细菌。
4. 将细胞重悬于 200 μl 冰冷的碱性裂解液Ⅰ中。将细胞转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。
5. 向管中加入 400 μl 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上。
6. 向管中加入 300 μl 冰冷的碱性裂解液Ⅲ，轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上 5 min。
7. 在微量离心机上以最大速度 4℃ 离心 5 min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入 900 μl 异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。
8. 立即在微量离心机上室温下以最大速度离心 5 min，使核酸沉淀。弃去上清，用 1 ml 70% 乙醇小心漂洗沉淀。室温下离心 2 min，吸去乙醇。在室温下干燥沉淀 5~10 min。将湿沉淀溶于 50 μl TE ( pH 8.0) 中。
9. 用限制性内切核酸酶消化 BAC DNA。
10. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用大小适合的 DNA 标准参照物。
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